灵芝多糖的结构特征研究.doc

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1、灵芝多糖的结构特性分析何晋浙邵平孟祥河孙培龙本文系浙江省科技厅和国家高技术研究发展计划863计划资助项目（No.2008C32030,No.2007AA10Z337）（浙江工业大学生物与环境工程学院食品系，杭州310032）摘要采用沸水回流法从灵芝子实体中提取多糖，经Sevage法除蛋白，乙醇沉淀，离心、透析、膜分离,浓缩、冻干后得灵芝多糖。经高碘酸氧化、Smith降解及甲基化反应，并利用多糖及刚果红混合液在碱性溶液中的波长的红移变化，通过UV-VIS、IR、GC、GC-MS、NMR对灵芝水提多糖的结构特征及三螺旋体结构进行分析研究。结果表明：灵芝

2、多糖含有三螺旋体构型，GC-MS分析灵芝多糖的主要单糖组分为葡萄糖,和少量的半乳糖、甘露糖、木糖、艾杜糖，IR及1H—NMR分析多糖为β-构型,高碘酸氧化、Smith降解和甲基化分析说明：多糖主要为(1→3)糖苷键连接构型,并伴有少量的1→6位支链键连接的结构，灵芝多糖是由D-葡萄糖单元通过β-(1→3)糖苷键连接葡聚多糖，其主要构型特征为(1→3)β-D-线性连接的骨架结构，其主要结构为下列构型：关键词灵芝多糖，结构特性，β-葡聚糖，三螺旋体1引言灵芝是中国名贵的中药材，其具有滋补强身、扶正固本、久服有轻身延年之功效，属多孔菌科类真菌[1]。其水

3、提物的主要活性组分是多糖。近年来越来越多的报告显示真菌多糖具有强烈的抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖及免疫活性作用[2]。而真菌多糖的生物活性与多糖的结构存在特别重要的构效关系[3]。目前，虽然对灵芝多糖的活性研究报道较多，但对其多糖结构作全面深入的分析研究报道并不是很多。蒋志国等[4]采用HSCCC方法分离纯化香菇中的多糖；孙元琳等[5]采用红外光谱和GC方法分析当归多糖水解后的单糖组成。本研究主要对赤灵芝多糖结构进行提取、纯化、通过膜分离，并经高碘酸氧化、及甲基化反应，通过紫外可见光谱（UV-VIS）、红外光谱（IR）、GC-MS、核磁共

4、振（NMR）对灵芝多糖进行三旋螺旋体结构及多糖的结构特性进行了全面的分析研究。以进一步促进灵芝多糖的药理作用及其构效关系的研究。2实验部分2.1仪器与试剂Labscale小型切向流超滤系统（美国Millipore公司），UV2450紫外分光光度计(日本岛津公司)；Nicolet6700型红外光谱仪(美国尼高力公司)；美国Agilent6890N气相色谱仪，毛细管色谱柱：DB－1701；质谱为FinnigantraceDSQII气相色谱质谱联用仪（美国热电公司），色谱柱：DB－1；核磁共振仪为：ANANCEⅢ(500M)（瑞士Bruker公司）。三氟

5、乙酸、赤鲜醇、岩藻糖、阿拉伯糖为进口试剂，其余单糖、化学试剂均由国内化学试剂公司采购，为分析纯试剂，Sevage为氯仿--正丁醇（4:1，v/v)混合溶液。2.2实验方法2.2.1多糖的提取与纯化灵芝子实体为灵芝（金华寿县谷药业有限公司提供）。灵芝子实体切片后粉碎，分多次称取60克，按料液比1：10在微沸状态下回流2h，取上层清夜，残渣反复提取3次，合并上清液，真空浓缩。并以Sevage法除蛋白，在每100mL的浓缩液加20mLSevage试剂,剧烈震荡30min,以4000r·min-1的速率离心15min,取上清液加无水乙醇至溶液含量达95%,

6、静置过夜,收集沉淀物。再依次用95%乙醇,乙醚,丙酮洗涤各两次,得粗多糖。再用蒸馏水溶解，经Millpope超滤器和采用10K膜包蒸馏水透析8h,分别以10K、30K、50K、100K膜包下截流组分，浓缩、以乙醇沉淀提取，冷冻干燥制得灵芝多糖。2.2.2甲基化反应以改良Hakmori法进行多糖甲基化反应[6]。经O2P5充分干燥的灵芝多糖样品15mg置于反应瓶中，在充N2及磁力搅拌下，以6mL干燥的二甲亚砜（DMSO）至充分溶解多糖样品，加入240mgNaOH，搅拌30min，在室温下避光过液，随后在冰浴中，缓慢加入3.6mLICH3,在常温超声浴

7、中反应8min后，通N2驱赶剩余的ICH3，重复2次甲基化，12KMWCO透析袋流水透析24h，浓缩和冻干，至多糖甲基化IR图谱在3400cm-1处无羟基吸收峰。2.2.3多糖乙酰化反应在6mg甲基化多糖样品中加入2mL甲酸，100℃密闭水解6h，减压蒸发至干，再加人2mol/L三氟乙酸4mL，110℃密闭水解6h，减压蒸发至干，加甲醇3mL,减压蒸发至干，如此重复3次。溶解于5mL蒸馏水中，加30mg硼氢化钠（NaBH4）于室温下还原3h，然后用冰醋酸中和过量的NaBH4，加入少量甲醇，减压浓缩蒸干，重复3次。真空干燥过夜后，加12mL醋酸酐，1

8、00℃反应1h。再加入少量甲苯，减压浓缩蒸干，溶于3mL氯仿中，用少量蒸馏水充分振荡洗涤，如此重复3次。氯仿层以适量无水硫