灵芝多糖的结构特征分析

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第3期2010年3月ChineseJournalofAnalyticalChemistry372—376DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．00372灵芝多糖的结构特征分析何晋浙邵平孟祥河孙培龙(浙江工业大学生物与环境工程学院食品系，杭州310032)摘要采用沸水回流法从灵芝子实体中提取多糖，经Sevage法除蛋白，乙醇沉淀，离心、透析、膜分离，浓缩、冻干后得灵芝多糖。经HIO氧化、Smith降解及甲基化反应，并利用多糖及刚果红混合液在碱性溶液中的波长的红移变化，通过uV—VIS，IR，GC，GC—MS，NMR对

2、灵芝水提多糖的结构特征及三螺旋体结构进行分析研究。结果表明：灵芝多糖含有三螺旋体构型，GC．MS分析灵芝多糖的主要单糖组分为葡萄糖，还有少量的半乳糖、甘露糖、木糖和艾杜糖，IR及HNMR分析多糖为．构型，HIO氧化、Smith降解和甲基化分析表明：多糖主要为(1—3)糖苷键连接构型，并伴有少量的1—6位支链键连接的结构，灵芝多糖是由D-葡萄糖单元通过卢一(1—)糖苷键连接葡聚多糖，其主要构型特征为(1—3)卢一D．线性连接的骨架结构。关键词灵芝多糖；结构特征；一葡聚糖；三螺旋体1引言灵芝是中国名贵的中药材，具有滋补强身、扶正固本、轻身延年之功效，属多孔菌科类真菌¨J，其水提物的主

3、要活性组分是多糖。近年来，越来越多的研究表明，真菌多糖具有强烈的抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖及免疫活性作用。而真菌多糖的生物活性与多糖的结构存在重要的构效关系J。目前，虽然对灵芝多糖的活性研究报道较多，但对其多糖结构作全面深入的分析研究报道鲜见。蒋志国等采用高速逆流色谱方法分离纯化香茹中的多糖；孙元琳等采用红外光谱和GC方法分析当归多糖水解后的单糖组成。本研究主要对赤灵芝多糖结构进行提取与纯化，采用膜分离，并经HIO氧化及甲基化反应，通过紫外可见光谱(uV-VIS)、红外光谱(IR)、气相色谱．质谱(GC．MS)、核磁共振(NMR)对灵芝多糖三旋螺旋体结构及多糖的结构特

4、性进行了全面的分析研究，以促进灵芝多糖的药理作用及其构效关系的研究。2实验部分2．1仪器与试剂Labscale小型切向流超滤系统(美国Millipore公司)；UV2450紫外分光光度计(13本岛津公司)；Nicolet6700型红外光谱仪(美国尼高力公司)；6890N气相色谱仪(美国Agilent公司)，DB一1701毛细管色谱柱；FinnigantraceDSQII气相色谱一质谱联用仪(美国热电公司)，DB．1色谱柱；ANANCE111500M核磁共振仪(瑞士Bruker公司)。三氟乙酸、赤鲜醇、岩藻糖、阿拉伯糖为进口试剂，其余单糖与试剂均为国产分析纯试剂，Sevage试剂为

5、氯仿．正丁醇(4：1，)混合溶液。2．2实验方法2．2．1多糖的提取与纯化灵芝子实体为灵芝(金华寿县谷药业有限公司提供)。灵芝子实体切片后粉碎，分多次称取60g，按料液比1：10在微沸状态下回流2h，取上清液，残渣反复提取3次，合并上清液，真空浓缩。并以Sevage法除蛋白，在每100mL浓缩液中加20mLSevage试剂，剧烈振荡30min，以4000r／min离心15min，取上清液，加无水乙醇至溶液含量达95％，静置过夜，收集沉淀物。再依次用95％乙醇、乙醚、丙酮洗涤各两次，得粗多糖。再用蒸馏水溶解，经Millpope超滤器和采用l0K膜包蒸馏水透析8h，分别取lO，30，

6、50和i00K膜包下截流组分，浓缩、以乙醇沉淀提取，冷冻干燥制得灵2009-07-05收稿；2009-09-29接受本文系国家高技术研究发展计划863计划(No．2007AA10Z337)和浙江省科技厅项目(No．2008C32030)资助$E—mail：sunpeil@163．corn第3期何晋浙等：灵芝多糖的结构特征分析373芝多糖。2．2．2甲基化反应以改良Hakmori法进行多糖甲基化反应。经P：O充分干燥的15mg灵芝多糖样品置于反应瓶中，在充N及磁力搅拌下，以6mL除水的二甲亚砜(DMSO)充分溶解多糖样品，加入240mgNaOH，搅拌30min，在室温下避光过夜，随

7、后置于冰浴中，缓慢加入3．6mLCH，I，在常温超声浴中反应8min后，通N驱赶剩余的CHI，重复2次甲基化，12KMWCO透析袋流水透析24h，浓缩和冻干，至多糖甲基化，IR图谱在3400cm处无羟基吸收峰。2．2．3多糖乙酰化反应在6mg甲基化多糖样品中加入2mL甲酸，100℃密闭水解6h，减压蒸发至干，再加入4mL2mol／L三氟乙酸，110qC密闭水解6h，减压蒸发至干，加3mL甲醇，减压蒸发至干，如此重复3次。溶解于5mL蒸馏水中，加30mgNaBH，于室温下还原3h，