鸡白细胞介素2基因与鸡毒支原体H3株TM1基因的串联及原核表达

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1、摘要为了提高鸡毒支原体DNA疫苗的免疫效果，本研究运用分子克隆技术，获得了鸡白细胞介素2基因，然后将其与鸡毒支原体H3株TM-1基因进行串联构建了融合基因，并在原核细胞中进行了表达。首先，根据GenBank中已登录的鸡白细胞介素2eDNA序列以及原核表达质粒pET-30a的多克隆位点，自行设计引物，为了便于基因的克隆和表达，我们在引物的5’端和3’端设计了相应的酶切位点、保护位点、连接臂、起始密码和终止密码。应用反转录聚合酶链式反应(RT-PC鼬技术，从经ConA诱导培养6h的鸡脾淋巴细胞中扩增获得了大小约为460bp的DNA片段，将其连接到pMDl9．T质粒上，经蓝白斑筛选、质粒PCR和双

2、酶切鉴定后，筛选获得阳性重组克隆pMDl9．T-IL-2。核苷酸序列测定分析表明，与GenBank中登录的鸡白细胞介素2cDNA序列一致，这表明已成功克隆了鸡白细胞介素2基因。其次。运用DNA重组技术将鸡白细胞介素2基因和鸡毒支原体H3株TM一1基因进行串联，插入到pET-30a质粒的EcoRI和HindIII多克隆位点之间，经质粒PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定，结果表明已成功构建了含鸡毒支原体143株TM-1基因和鸡白细胞介素2基因的融合基因，并将含有此融合基因的重组质粒命名为pET-30a-TM—l-IL-2。最后，将此重组质粒转化E．coliBL21(DE3)菌株。经IPTG37℃诱

3、导表达4h后，SDS．PAGE电泳结果显示，融合蛋白得到了表达，分子量约为43kDa，主要以包涵体形式存在。表达产物在尿素存在下经超声波处理，获得了纯化的融合蛋白。这为为进一步研究鸡白细胞介素2及鸡毒支原体的生物学活性奠定了基础。综上所述，本研究成功地构建了含鸡毒支原体H3株TM一1基因和鸡白细胞介素2基因的重组表达质粒，并将其导入原核细胞进行了表达。这为进一步研究鸡毒支原体DNA疫苗奠定了实验基础。关键词：鸡毒支原体；白细胞介素2；融合基因；原核表达CascadeConnectionandProkaryoticExpressionofChIL一2GeneandMycoplasmaGalli

4、septicumH3StrainTM一1GeneAbstractInordertofurtherresearchDNAvaccineofMGandimproveitsefficiencyinimmuneresponse，weclonedchickenIL-2genebymeansofthegenemanipulationtechnologyandconstructedrecombinantplasmidcontainingTM·-1·-IL·-2fusiongene．Thesegeneswerewellexpressedinprokaryoticexpressioncells．Firstly

5、，accordingtotheChIL一2eDNAsequenceregisteredinGenBankandmulti-clonerestrictionenzymesitesofprokaryoticexpressionplasmidpET一30a(+)，wedesignedonepairsofspecialprimersfortheChIL一2geneTomanupulatethecloningandexpressionoftheChlL一2genes，correspondingendonuclesaesites，protectivesites，linkers，inititationan

6、dterminationcodonsweredesignedatthe5’terminaland37terminalofthePCRprimers．Byreversetranscriptasepolymerasechainreaction(RT—PCR)，theDNAfragmentabout460bpwasamplifiedfromchickenspleenceHsthatwerestimulatedwithConAfor6hours，furldaermore，thefragmentwasinsertedintopMDl9一TvectorandidentifiedwithPCRandres

7、trictionenzymedigestion，thepositiverecombinantcloneswassequencedandanalyseditwastheChIL一2cDNAsequenceregisteredinGenBank．TheresultssuggestedthatChlL一2genewasclonedsuccessfully．Secondly，bythetechnologyofDNAr