饲料及其原料中赭曲霉毒素A的测定-免疫亲和柱-高效液相色谱法

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1、2011年第6期江西饲料瓠饲料及(1．江西工业贸÷：摘要：赭曲霉毒素A存在于各种食品和饲料中，免疫亲和柱作为一新够净化技术，在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛。它的原理是利用免疫反应的高度特异性需净化的毒素固定在免疫亲和柱上，检测结果准确、可靠。关键词：赭曲霉毒素A；免疫亲和柱；高效液相色谱法中图分类号：S816．17文献标识码：A文章编号：1008—6137(2011)06~0028—030引言基异氧杂奈邻酮(香豆素)[31。分子量为403，是一赭曲霉毒素(Oehratoxins)是由真菌产生的一种无色的晶体状

2、化合物，在紫外光下呈兰色荧组结构类似的有毒的次级代谢产物，主要危害人光，能溶于极性有机溶剂，微溶于水，呈弱酸性．和动物的肾脏，有A、B、C、D四种化合物。其中毒它的苯基丙氨酸部分的pKa=4．4．酚羟基pKa=性最大、分布最广、对农作物的污染最严重、与人7-3或7．05，能溶于稀的碳酸氢盐水溶液。在有类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A(Ochratoxin机溶剂和碱水中，OTA对空气与光不稳定，尤其A，OTA)。OTA主要产生菌是赭曲霉(Asperillus在潮湿环境中，短暂的光照都能使之分解，但在ochraeeus

3、)和纯绿青霉(Penfcilliumverrucosum)[1】。乙醇溶液中低温可保存一年。OTA对热不太稳OTA作为一种天然污染物主要分布于温带地区定，高温可使之分解产生氯气与氧化氮。当以苯一的国家，存在于各种食品和饲料中。德国、法国、乙酸(99：1。v，v)为溶剂时，最大吸收峰的波长为美国、意大利、葡萄牙和北欧各国连续多年报道333nm．摩尔吸光系数为5500了OTA的污染情况。OTA对食品污染的范围较广。包括谷物、豆类、咖啡豆、可可豆、葡萄干、啤酒和葡萄汁等。而且，它还可通过母亲的血液转入到乳汁中去。1993

4、年国际癌症研究机构(TheInternationalAgencyforResearchonCancer，Cl图1—1OTA的结构式IARC)已将OTA列为可能的人类致癌物翻。1赭曲霉毒素A理化性质2赭曲霉毒素A毒性及限量标准OTA的化学名称为7一(L—p一苯基丙氨基一OTA毒性较大，主要靶器官是肾脏，能引起羰基)一羧基一5一氯代一8一羟基一3，4一二氢化一3R-O肾脏疾病。动物试验表明，OTA可导致实验动物一28一江西饲料2011年第6期肝肾损害，诱发肝肾肿瘤。另外，OTA还具有免需要低温保存。此外，这些方法都具有

5、如下共同疫抑制毒性、神经毒性、致畸性及致癌性。为此，的不足之处：世界粮农组织和世界卫生组织食品添加剂专家1)在对样品进行预处理过程中，需要使用多委员会(TheJointFAO／WHOExpertCommittee种有毒、异味的有机溶剂，不仅毒害操作人员，而onFoodAdditives。JECFA)经过对OTA肾脏毒且污染环境。性的评价后．建议每周OTA最大耐受摄入量为2)操作过程烦琐、时间长，劳动强度大。0．1p~g／kgbw。许多国家和组织对食品、饲料中的4免疫亲和柱净化高效液相色谱法测定饲料OTA制定了严格的

6、限量标准(见表1)。及饲料原料中赭曲霉毒素A方法表1部分国家食品和饲料中OTA的限量标准采用免疫亲和柱净化一高效液相色谱法测定饲料中的赭曲霉毒素A具有相对安全、快速和准确的特点，是目前国际普遍采用先进的分析方法。婴儿食品14．1范围捷克和斯洛伐克儿童食品5适用于饲料及饲料原料中赭曲霉毒素A的猪肾脏25测定．本标准检测范围为0～100p~g／kg，检出限为10kg。4．2原理样品与甲醇一水提取液混合．高速均质提取后过滤．滤液过含赭曲霉毒素A特异抗体的免疫亲和柱层析净化，甲醇洗脱，洗脱液经氮气吹干，流动相定容后供带有荧

7、光检测器的高效液相色谱仪测定，外标法定量。4．3分析步骤4-3．1样品处理1)准确称取粉碎试样50．Og随着科学技术的发展，检测水平的提高，对(精确到O．1g)于250mL具塞锥形瓶中，加入5．Og食品中的OTA限量标准的要求也在不断地提高。氯化钠，加入100mL甲醇一水(80+20，v／v)。将搅拌欧洲食品科学委员会(TheEuropeanScientific杯置于均质器上，高速搅拌提取lmin，或摇床震CommitteeforFood。ESCF)已建议将食品中的荡60min。提取液经槽纹折叠滤纸过滤于干净的A兀

8、、(Aflatoxins)、AFB1(AflatoxinB1)、0TA的含烧杯中。准确移取10．0mL滤液并加入40．0mL量降低到检测技术能达到的最低检测限。为此，PBS缓冲液稀释．混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤该委员会制定了新规定NO．466／2001(表21嘲。至澄清后，随即进行免疫亲和柱净化操作。表2欧洲食品科学委员会制定的食品中OTA限量标准2)将免