雷帕霉素对骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞体外增殖、凋亡及趋化因子受体CXCR4表达的影响

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名：。昧嘭铎，，导师签名：固趣钾学院领导签名：妻Z盈如，P年0月二7日研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容

2、外，文中不包含其他入已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文Eh本人独立撰写，文责自负。研究生龇溉导师签名．洲彩z啪P年岁月qEl中文摘要雷帕霉素对骨髓瘤细胞系RPMl8226细胞增殖、凋亡及趋化因子受体CXCR4表达的影响摘要目的：Rapamycin作为mTOR的抑制剂广泛应用移植物排斥反应。近年来，有研究表明rapamycin体外有抑制骨髓瘤细胞系增殖作用，体内应用于荷骨髓瘤小鼠模型使瘤体缩小。Rapamycin对MM细胞作用的机制尚未完全阐明。本研究将mTOR抑制剂rapamycin应用于人MM细胞系RPMl8226细胞，

3、观察rapamycin对RPMl8226细胞增殖、凋亡的影响。有学者研究发现，cyclinDl在细胞增殖过程中起着重要的作用，在MM细胞呈高表达，与IVIM细胞的增殖相关，检测rapamycin作用前后MM细胞cyclinDl的表达情况，可以了解rapamycin抑制MM细胞增殖并诱导其凋亡是否与cyclinDl表达调控有关。CXCR4作为趋化因子受体在MM细胞归巢中起着重要的作用，通过CXCR4／SDF一1使MM细胞定位于骨髓。有研究表明CXCR4阳性的造血细胞可以使AKT磷酸化，同时诱导分泌VEGF，进而促进肿瘤的发生。本研究通过检测rap

4、amycin作用后CXCR4在RPMl8226细胞中mRNA以及蛋白水平的表达变化，进一步探讨rapamycin对骨髓瘤细胞作用的分子生物学机制，为本药临床应用奠定理论基础。方法：l细胞培养和传代1．1人类MM细胞株RPMl8226的培养和传代中文摘要人MM细胞株RPMl8226，培养于含20％灭活胎牛血清(FBS)、lOOU／ml的青霉素和100lag／ml硫酸链霉素的RPMll640培养液中，置37。C、5％的二氧化碳的培养箱中培养，每5—6天传代1次，实验用对数生长期的细胞。2Rapamycin对RPMl8226细胞生长抑制的影响2．1M

5、TT法检测rapamycin对RPMl8226细胞生长抑制的影响取对数生长期的RPMl8226细胞，调整细胞密度为2×105／ml，加入不同浓度的rapamycin分别作用24h、48h、72h，培养结束前4h加入20ulMTT(5mg／m1)；离心培养板，小心吸去上清，加入DMSO200lal，振荡溶解formazon结晶，酶标仪490nm测A值，绘制细胞生长曲线。2．2Rapamycin对RPMl8226细期周期阻滞的影响应用流式细胞术检测。在细胞培养体系中加入不同浓度的rapamycin，培养48h后，收集细胞，4。C低速离心，PBS洗涤

6、2遍。加入．20。C预冷的80％乙醇2ml混匀，4"C过夜。用PBS洗涤2次，lOgm的PI染液染色30min，上FACSCallibur流式仪检测，CellQuest软件进行细胞周期分析，计算各期细胞所占的比例。实验重复3遍。2．3Rapamycin对RPMl8226凋亡的影响采用倒置显微镜下原位形态学观察及FCM检测Sub．G1期细胞比例方法。3Rapamycin对人MM细胞株RPMl8226趋化因子受体CXCR4、cyclinD和mTOR表达的影响3．1流式细胞术检测rapamycin对RPMl8226细胞表面趋化因子受体CXCR4表达率

7、的影响取对数生长的RPMl8226细胞，调整细胞密度为2×中文摘要105／m1，接种于24孔培养板，加入不同浓度rapamycin作用24h后，收集细胞，用冷PBS洗两遍后，各取细胞悬液100ul，分别加入CDl84(CXCR4单抗)61．tl，对照组加入CD46lal，轻轻混匀，室温避光反应30分钟，立即在流式细胞仪上检测，计数104细胞，以对照管作为阴性对照，CELLQuest软件分析，粘附分子CDl84表达水平以阳性细胞百分数表示。3．2半定量逆转录一聚合酶链反应(semiquantitativereversetranscriptionp

8、olymerasechainreaction，RT-PCR)方法检测rapamycin不同浓度不同时间作用于RPMl8226细胞后CXCR4和cycl