贻贝粘合蛋白Mgfp-5基因在菊苣中的表达研究

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1、分类号：Ｑ２学校代码：１０６９７密级：公开学号：２０１４２０８３５＿硕士学位论文’ＳＤＩＯＮＭＡＳＴＥＲＩＳＳＥＲＴＡＴ贻贝粘合蛋白ｆｐ－５基因在菊苣中的表达研究学科名称：细胞生物学作者：吕亚维指导老师：王英娟副教授西北大学学位评定委员会二〇一八年ExpressionofMytilusgalloprovincialisfootproteintype5(Mgfp-5)GeneinChicory(CichoriumintybusL.)AthesissubmittedtoNorthwestUniversityi

2、npartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofMasterinCellBiologyByLvYaweiSupervisor:WangYingjuanAssociateProfessorSeptember2018摘要贻贝粘合蛋白（MusselAdhesiveProtein，MAPs），亦称贻贝足丝蛋白（Mytilusfootproteins，Mfps）是海洋软体动物贻贝（Mytilidae）足部的足丝腺分泌的一类具有极强黏性的蛋白质复合物。由于其液体环境下的强黏合能力、可降解性和极好的生物相容性

3、的生物特点，常被用作生物医药粘合剂及优质的医用粘合剂。天然的MAPs，提取时易固化、含量低且成本高，研究者开始借助基因工程技术，在原核表达（大肠杆菌）及真核表达（酵母、烟草）系统中重组表达MAPs，探索重组蛋白的性质及功能。原核表达的重组MAPs需在体外经酪氨酸酶修饰后，才有一定的黏性，且表达量或者黏附性能均不如意；真核表达系统可以表达重组MAPs的基因，但是真核重组蛋白的表达量及重组蛋白的性能研究还没见到相关资料。植物表达系统中有着比较高级的真核蛋白合成途径，表达外源蛋白时可以在植物体内进行糖基化和磷酸化等修饰，在重组蛋白的体外修饰中就可降低成

4、本，减少体外修饰带来的毒性，有着安全性和规模化生产的优点。已有在烟草中重组表达地中海贻贝粘合蛋白（MytilusgalloprovincialisFootProtein，Mgfp-5）的研究，但还很薄弱。经济作物菊苣（CichoriumintybusL.）具有组织培养简单、再生能力强、遗传转化效率高等优点，是植物基因工程常用受体之一。目前已经在菊苣中成功表达了γ-zein基因、小麦的Na+/H+逆向转运蛋白（简称NHX，NHE或NHA）、动物口服型疫苗、AFL2基因、结核分枝杆菌结核抗原ESAT6等，但是还没有见到以菊苣为受体植物表达MAPs的相

5、关研究。本研究选用菊苣作为植物受体材料，通过农杆菌介导法，将含有Mgfp-5基因的植物表达载体pRI101-Mgfp导入植物菊苣基因组中，抗性筛选培养之后，经PCR、RT-PCR及Westernblotting方法鉴定得到转基因菊苣植株，并提取纯化得到重组Mgfp-5，最后通过原子力显微镜（AtomicForceMicroscopy，AFM）和石英晶体微天平（QaurtzCrystalMicrobalance，QCM）分析重组蛋白Mgfp-5的黏附能力。所取得的主要研究结果如下：1.建立了用于遗传转化的菊苣的离体再生体系：选用菊苣叶片外植体，在附

6、加100mg/L维生素C（Vc）、1.5mg/L6-BA和0.2mg/LNAA的MS培养基上可以诱导愈伤组织和不定芽，诱导率分别为95.67±2.84%和79.18±5.58%；不定芽在添加100mg/LVc和0.1mg/LNAA的1/2MS培养基上后可以诱导出根，生长健壮，诱导率为97.33±I0.88%。2.农杆菌介导转化时，优化了影响遗传转化效率的条件：菊苣叶片外植体在预培养3d、农杆菌密度OD600=0.6、侵染10min和共培养3d时，附加50mg/L卡那霉素的选择压下可以获得转化菊苣植株。3.获得菊苣转基因植株：利用PCR和RT-PC

7、R技术分析转化植株，均检测到外源Mgfp-5基因的目标条带（约260bp大小）。检测的150株阳性转化植株（T0）中，外源基因Mgfp-5整合率为32.67%，表达率为73.47%。4.T1代转Mgfp-5基因菊苣植株分析：收获T0代菊苣种子，利用PCR和RT-PCR追踪分析T1代健康小植株的目的基因，Mgfp-5基因仍然可以在基因水平上稳定遗传表达，遗传率为67.71%，表达率为70.77%。通过X2检验统计PCR检测的数据结果，分析其遗传规律，有44.44%的转基因植株遵循孟德尔遗传规律3:1。5.Mgfp-5基因在转基因菊苣中的表达和蛋白纯

8、化：WesternBlotting分析叶片总蛋白，表明重组Mgfp-5蛋白能够在T1代转基因菊苣中稳定表达，其表达率为58.70%；借助