猪体细胞核移植早期胚胎的合子基因激活及表观遗传修饰的研究

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1、猪体细胞核移植早期胚胎的合子基因激活及表观遗传修饰的研究TheStudyonZygoticGeneActivationandEpigeneticModificationduringPorcineSomaticCellNuclearTransferEarlyEmbryoDevelopment作者姓名：张志人专业名称：动物学研究方向：干细胞与动物克隆指导教师：李子义学位类别：理学博士培养单位：动物科学学院论文答辩日期：2018年6月4日授予学位日期：2018年6月20日答辩委员会组成：姓名职称工作单位主席张永亮教授华南农业大学委员曾林研究员军事科学院陈振文教授首都医科大学张嘉保教授吉林

2、大学赵志辉教授吉林大学滕利荣教授吉林大学任文陟教授吉林大学本研究得到国家重点研发计划(No:2017YFA0104400)、2016年长江学者和创新团队发展计划(PCSIRT,No.IRT_16R32)以及吉林大学科技创新团队项目(JLUSTIRT)资助。ThisworkwassupportedbytheNationalKeyR&DProgramofChina(No:2017YFA0104400),ProgramforChangjiangScholarsandInnovativeResearchTeaminUniversity(PCSIRT,No.IRT_16R32)andProg

3、ramforJLUScienceandTechnologyInnovativeResearchTeam(JLUSTIRT).I内容提要在哺乳动物胚胎发育过程中，合子基因激活作为一个里程碑式的事件，对于早期胚胎发育具有十分重要的意义。体细胞核移植（Somaticcellnucleartransfer，SCNT）胚胎中通常存在着异常的合子基因激活现象，异常的表观遗传修饰可能是造成合子基因激活障碍的重要因素之一。本研究以猪SCNT胚胎和体内受精（Invivofertilization，IVV）胚胎为研究对象，通过单细胞转录组测序和基因芯片（PCRarray）检测技术研究了它们早期胚胎发育

4、过程中的合子基因激活情况以及84种表观遗传修饰酶的表达模式。结果显示：（1）猪早期IVV胚胎的转录组呈现动态的变化模式，4细胞之前以母源因子调控为主，在4细胞阶段合子基因启动激活转录。对4种哺乳动物早期胚胎的转录组/表达谱合并分析表明，合子激活是胚胎发育过程中一个物种保守的生物学事件，猪、人、小鼠和牛早期胚胎都具有其特有的合子基因激活时间和基因表达模式。四种哺乳动物合子激活时期的差异表达基因在基因功能和通路上的富集大部分具有共通性，同时也有各自特异性，其中猪与牛最为相似；（2）比较猪IVV和SCNT早期胚胎的转录组图谱发现，猪早期SCNT胚胎4细胞阶段存在严重的合子基因激活障碍，未

5、能正常转录表达的合子基因大部分与核糖体合成和翻译相关。猪早期SCNT胚胎存在异常高水平的H3K4me3修饰，且4细胞阶段多种H3K4甲基转移酶在转录组水平上呈现整体异常上调的情况；（3）组蛋白H3K4甲基转移酶MLL1的小分子抑制剂MM-102显著提高了猪SCNT植入前胚胎的发育能力，提高了多能性基因（NANOG、POU5F1）和抗凋亡基因BCL2的表达，降低凋亡基因BAX的表达，增加了囊胚的总细胞数并降低了凋亡细胞的比例，使其各方面都与IVV胚胎更加相似。MM-102的添加明显改善了猪SCNT胚胎合子激活及囊胚阶段整体异常的表观遗传修饰酶表达模式，同时也下调了H3K4me3、H3

6、K4me2、H3K9me3和5mC的整体修饰水平，使其更接近于IVV和IVF胚胎。中文摘要猪体细胞核移植早期胚胎的合子基因激活及表观遗传修饰的研究在哺乳动物中，胚胎发育的初期是由来源于卵母细胞的母源因子调控发育进程，此时的合子基因组处于转录沉默状态。随着卵裂的不断发生，母源因子被逐渐消耗，合子基因组适时地激活，调控发育的主导地位完成由母源向合子的转变。几乎所有哺乳动物的早期胚胎体外培养都会发生发育阻滞的现象，而主要的发育阻滞期与合子激活的时间正好重叠，这充分说明合子基因的正确激活对于早期胚胎的发育具有十分重要的意义。人们致力于体细胞核移植（Somaticcellnucleartra

7、nsfer，SCNT）研究已有50多年，克隆效率低下一直是制约该技术应用的最主要的原因。以往的研究发现，小鼠和人的SCNT早期胚胎存在合子基因激活的异常，这导致了体细胞重编程的不完全和胚胎发育的阻滞，而异常的表观遗传修饰是造成合子激活障碍的关键原因之一。猪是一种有重要经济价值的家畜，此外还可以作为生产人源化蛋白的生物反应器，以及异种器官供体的理想动物模型，所以提高猪体细胞克隆效率的研究具有十分重要的科研意义和应用价值。以往的研究很少在转录组水平上对猪SCNT胚胎的合子