TLR2%2CNLRP3在钩端螺旋体感染过程中的作用及机制研究

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1、分类号：S856.6单位代码：10183研究生学号：2015851017密级：公开吉林大学博士学位论文TLR2，NLRP3在钩端螺旋体感染过程中的作用及机制研究TherolesandmechanismsofTLR2andNLRP3inleptospirainfection作者姓名：张文龙专业：临床兽医学研究方向：奶牛乳腺炎诊断防治指导教师：张乃生教授培养单位：动物医学学院2018年6月本课题项目受到国家自然科学基金项目，国家重点研发计划项目，公益性行业（农业）科研专项资助（项目编号：315725

2、82，2016YFD0501005，201303042）中文摘要TLR2，NLRP3在钩端螺旋体感染过程中的作用及机制研究钩端螺旋体（钩体）分为致病性问号钩体和非致病性腐生型双曲钩体两类。钩体病是由致病性的钩体引起的一种广泛传播的自然疫源性人畜共患病，猪、马、牛、羊以及人类都可感染此病，引起发热、黄疸、流产甚至死亡，给我国畜牧业生产和人类健康造成了极大危害。到目前为止，钩体病的详细发病机理还不能被完全阐明。钩体侵入动物体后，能迅速扩散至全身各个组织器官。天然免疫系统是机体对病原菌识别防御的第一道

3、防线。研究宿主天然免疫系统对钩端螺旋体的识别及反应机制，对钩端螺旋体病的防治具有重要意义。研究发现钩体能够激活细胞表面的模式识别受体——TLR2和TLR4，也可以激活胞内的模式识别受体——NLRP3。TLR2，TLR4的激活能启动核转录因子Nf-κB和MAPK信号通路，使细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-a等大量表达。而NLRP3炎性体的激活需要两个信号，第一个信号是TLRs介导的炎性细胞因子转录合成，第二个信号是通过与接头蛋白ASC结合，并招募Pro-caspase-1形成为―炎性小体‖的

4、复合物，激活caspase-1，从而对Pro-IL-1β等底物进行切割，使其成熟并释放到胞外。应用小鼠基因缺陷模型，已经发现缺陷TLR4或同时缺陷TLR2和TLR4的小鼠感染钩体后迅速死亡，但对于金黄地鼠及其他敏感动物来说，他们体内并不缺陷TLR2和TLR4，这些敏感动物在钩端螺旋体感染过程中，其体内的TLR2和TLR4到底发挥了怎样的功能还不清楚。由于钩体可以迅速穿透细胞膜，进入胞内，那么除NLRP3以外，胞浆中的其他炎性体是否也能识别侵入胞内的钩体呢？耐受动物与敏感动物感染钩体后，这些受体的

5、作用是否也有差异？对这些问题的解答将进一步揭示钩体的致病机制，为开发新的靶向防控生物制剂奠定理论和实验基础。因此，本论文从先天免疫识别受体的角度出发，通过对比钩体感染的两种动物模型——金黄地鼠敏感模型和小鼠耐受模型，探索TLR2、TLR4以及胞内炎性体（NLRP3、NLRC4）在钩端螺旋体感染过程中发挥的作用及机制，进而探究以调节TLR2，TLR4及NLRP3、NLRC4炎性体信号通络为靶点的药物在抗钩I端螺旋体感染中的应用价值。结果显示，钩体感染后，金黄地鼠体内TLR2的表达要明显滞后于BAL

6、B/c小鼠，而TLR4的表达没有明显的差异，因此，TLR2前期不表达或不激活可能是金黄地鼠对钩体易感的原因。为了验证上面的假设，TLR2缺陷的C57小鼠被用来接种钩体，同时，用TLR2的激动剂Pam3CSK4来治疗感染钩体的金黄地鼠，发现TLR2缺陷加重了小鼠感染钩体后的病理变化，相应的，应用TLR2激动剂Pam3CSK4则提高了金黄地鼠感染钩体后的存活率，表明TLR2的前期激活能有效控制钩体感染。为进一步探索TLR2发挥作用的分子机制，分析比较了TLR2下游的细胞因子在两种动物模型中的表达差异

7、，并检测了IL-10/TNF-α比值在野生型和TLR2缺陷型C57小鼠中，以及Pam3CSK4处理的金黄地鼠中的变化情况。发现TLR2的表达与IL-10有一定的协同性，并通过细胞实验进一步证明钩体引起的IL-10表达是由TLR2介导的。以上实验结果表明，TLR2的激活能有效控制钩体感染，该过程可能是通过提高IL-10水平或IL-10/TNF-α比值来实现的。对比金黄地鼠和C57小鼠感染钩体后NLRP3和NLRC4基因的表达差异，发现金黄地鼠中NLRP3的表达明显滞后于小鼠，而NLRC4在两种动物

8、感染前期都不表达，后期表达差异不大，表明NLRP3的差异表达可能是造成小鼠和金黄地鼠模型不同转归的原因。随后，应用NLRP3缺陷的C57小鼠，发现虽然野生型和NLRP3缺陷小鼠感染钩体后存活率没有差异，但NLRP3缺陷鼠体内的钩体量更低，组织病理变化更缓和，并且器官中IL-1β的水平与体内钩体量不相关，提示NLRP3缺陷后对钩体清除作用的加强并不依赖下游的IL-1β。为进一步证明以上观点，提取NLRP3、NLRC4、Caspase-11、Caspase-1-11缺陷的C57小鼠的腹腔巨噬细胞，进