核桃多肽抗Aβ1-42淀粉样蛋白聚集活性筛选及体内外吸收代谢研究

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1、硕士学位论文核桃多肽抗Aβ1-42淀粉样蛋白聚集活性筛选及体内外吸收代谢研究作者姓名杨柳学科专业食品科学与工程指导教师任娇艳教授所在学院食品科学与工程学院论文提交日期2018年4月TheFunctionalWalnutPeptidewithAnti-Amyloidβ1-42AggregationActivityanditsInVitro/InVivoAbsorptionandMetabolismStudyADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：YangLiuS

2、upervisor：Prof.RenJiaoyanSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou,China分类号：TS201学校代号：10561学号：201321020467华南理工大学硕士学位论文核桃多肽抗Aβ1-42淀粉样蛋白聚集活性筛选及体内外吸收代谢研究国家自然科学基金面上项目（31671804）广东特支计划科技青年拔尖人才项目（2014TQ01N645）广东省协同创新与平台环境建设项目（2017B090901063）作者姓名：杨柳指导教师姓名、职称：任娇艳教授申请学位级别：学

3、术型硕士学科专业名称：食品科学与工程研究方向：食品营养与健康论文提交日期：2018年4月12日论文答辩日期：2018年6月4日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：郑建仙教授委员：杨宝研究员、任瑞文研究员、孙世利副研究员、任娇艳教授摘要氧化应激反应在阿尔兹海默症（Alzheimer’sdisease，AD）的病程发展中发挥着重要的推动作用。通过抗氧化剂抑制细胞内氧化应激反应，从而减少自由基的产生和β-淀粉样蛋白（β-Amyloidprotein，Aβ）沉积的形成，已成为AD预防与治疗的新方向。

4、核桃是中国食疗中具有健脑功能的好食材，但其健脑机制尚不明晰，除了不饱和脂肪酸和二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸等大脑发育活性因子，核桃蛋白质因氨基酸种类齐全且富含精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等健脑物质被认为是健脑活性主要成分之一。作为核桃蛋白的酶解产物，核桃多肽因吸收率高、生物效价高、抗氧化性好引起研究者的关注。本论文旨在从核桃多肽中筛选强抗氧化肽，评价其抗Aβ聚集活性，分析其体内外吸收代谢情况和跨血脑屏障能力。本实验从核桃蛋白酶法制备（料液比1:10，酶解温度为55°C，碱性蛋白酶酶解，酶解时间为4h，加酶量为蛋白含量的0.75

5、%（w/w），pH7.0）的核桃多肽中选定WDQW肽（WW4），以WW4肽为基础设计WDQWCIW肽（WW7），合成、验证了两者良好的抗氧化活性。WW4肽和WW7肽的氧自由基清除能力（OxygenRadicalAbsorbanceCapacity，ORAC）分别为7.26±0.92和6.14±0.60µmolTrolox/µmolsample，约是抗氧化剂还原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）的10倍。WW7肽与WW4肽相比，氧自由基清除能力无显著性差异（p>0.05），但WW7肽的DPPH·清除能力显著高于WW

6、4肽（p<0.05），WW7肽的DPPH·清除能力IC50值为66.39±0.98µg/mL，DPPH·清除能力是还原型GSH的2.7倍。实验证实WW4肽和WW7肽均具有优于强抗氧化剂还原型GSH的体外抗氧化活性。利用E22G-mCherryHek293细胞对WW4和WW7肽进行抗Aβ聚集活性评价，采用IncucyteZoom长时间动态细胞成像仪和Amnis成像流式仪两种成像方法检测得0.5mmol/LWW7肽对Aβ聚集的抑制率分别为10.95±2.02%和23.04±13.64%，具有显著的抗Aβ聚集活性，WW4肽不具有

7、显著抑制Aβ聚集的活性。进一步研究WW7肽对Aβ1-42-mCherry聚集诱导的下游反应的改善作用发现，WW7肽显著提高了诱导后E22G-mCherryHek293细胞的存活率，改善了周期S期阻滞现象，并降低了细胞内活性氧水平，证实WW7肽改善了细胞内氧化应激水平，具有清除细胞内自由基能力和显著的抗Aβ聚集活性，并降低了Aβ聚集导致的细胞损伤。利用Amnis成像流式仪对多肽的细胞内吸收代谢研究发现，WW7肽的吸收代谢速度均慢于WW4肽，WW7、WW4I肽与溶酶体的共定位率分别为1.39%和8.44%，WW4肽被溶酶体快速

8、消化代谢，WW7肽具有更好的细胞内代谢稳定性。WW4肽因其在细胞内的快速代谢导致其生物利用度较低，不具有抑制Aβ聚集等相关生理活性。利用动物活体成像，对尾静脉注射FITC、FITC-WW4肽和FITC-WW7肽的BALB/c裸鼠进行多肽的体内吸收代谢和跨血脑屏障能力研究。活体实验证实，WW7肽的体内吸收