白曲霉酸性蛋白酶在无孢黒曲霉SH-2中的表达研究

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1、专业学位硕士学位论文白曲霉酸性蛋白酶在无孢黒曲霉SH-2中的表达研究表达研究作者姓名董文超学科专业生物工程指导教师潘力教授校外导师吴新良总经理所在学院生物科学与工程学院论文提交日期2018年4月ExpressionofKawachiiAcidProteaseinnon-sporeAspergillusnigerSH-2ADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：DongWenchaoSupervisor：Prof.PanLiSouthChin

2、aUniversityofTechnologyGuangzhou,China分类号：Q81学校代号：10561学号：201521034080华南理工大学硕士学位论文白曲霉酸性蛋白酶在无孢黒曲霉SH-2中的表达研究作者姓名：董文超指导教师姓名、职称：潘力教授申请学位级别：硕士学科专业名称：生物工程研究方向：微生物酶学论文提交日期：2018年4月12日论文答辩日期：2018年6月1日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：吴振强委员：杜红丽吴海珍王领夏枫耿摘要酸性蛋白酶是适宜在

3、pH2-6条件下，有效水解蛋白质为氨基酸和小肽的酶类。由于酸性蛋白酶水解作用发生在酸性环境下，通常不会出现由于细菌繁殖而引起的腐化及变质，因而被广泛地应用于酿酒、饲料、皮革、医药等工业中[1]。目前研究的酸性蛋白酶主要来源于米曲霉、黑曲霉和宇佐美曲霉，而对白曲霉来源的酸性蛋白酶研究较少。本文采用低蛋白背景的无孢黑曲霉SH-2为宿主，以白曲霉酸性蛋白酶为基因供体，构建了一株能表达白曲霉酸性蛋白酶的重组菌株。主要研究结果如下：（1）生物信息学分析白曲霉酸性蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶家族，该酶共有394个氨基

4、酸，前20个氨基酸为信号肽，预测在氨基酸序列39处的-N-K-T是N-糖基化位点，此蛋白是亲水性蛋白。模型呈现凹槽状，两个活性中心位于凹槽内，有3个Zn结合位点，1个二硫键。（2）白曲霉酸性蛋白酶表达重组菌株经100mL淀粉摇瓶培养168h后，酶活为240U/mL，SDS-PAGE分析，白曲霉酸性蛋白酶分子量大小约为47KDa。在重组菌株30L上罐发酵过程中，限制补料和氯化铵的添加速率，可以保持发酵过程稳定的生理活性。将发酵pH控制在4.7~4.8范围内，菌体浓度维持在55%以上，可以实现发酵的稳产高

5、产，其发酵液酶活达到9972U/mL。（3）白曲霉酸性蛋白酶酶学性质研究白曲霉酸性蛋白酶酶最适反应温度为35℃，当温度低于25℃或高于50℃时，酶活都会显著降低。最适反应pH为4时，pH低于或高于4，酶活都会降低。pH值对白曲霉酸性蛋白酶活力影响非常显著，pH值小幅下降会引起酶活迅速下降。Mn2+、Cu2+对酶活有显著的激活作用，酶活分别是对照组的3倍和2.5倍，Zn2+、Mg2+对酶活的影响作用不明显，而Cd2+则对酶有明显的抑制作用。（4）白曲霉酸性蛋白酶对大豆分离蛋白水解的应用研究白曲霉酸性蛋白

6、酶对大豆分离蛋白的水解效果的最佳温度为60℃、最佳pH为5、最佳水解时间为3h以及最佳E:S为800:1，在此条件下，大豆分离蛋白的水解度达到6.6%，与黒曲酸性蛋白酶相比，白曲霉酸性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解能力更强。与其他种类蛋白酶的复合水解效果研究显示“碱性蛋白酶+白曲霉酸性蛋白酶”组合水解I效果提高显著。关键词：白曲霉酸性蛋白酶；重组表达；无孢黒曲SH-2；酶学性质研究IIAbstractAcidproteasesareenzymessuitableforefficientlyhydrolyz

7、ingproteinstoaminoacidsandsmallpeptidesatpH2-6.Sinceacidproteasehydrolysisoccursinanacidicenvironment,corruptionanddeteriorationduetobacterialgrowtharegenerallynotpresent.Thusacidproteaseiswidelyusedinthewine,feed,leather,pharmaceuticalandotherindustrie

8、s.Atpresent,moststudiesonacidicproteasesarefocusedonAspergillusoryzae,Aspergillusniger,andAspergillususamii,whiletherehavebeenfewstudiesontheacidicproteasesofAspergilluskawachii.Inthisstudy,astrainofAspergillusnigerSH-2withlowpro