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1、2014级生物工程专业实验(II)黑曲霉液态发酵生产酸性蛋白酶na一、实验目的掌握液态耗氧发酵的一般工艺，熟悉机械搅拌发酵罐及相关设备的原理和使用。二、实验材料黑曲霉AspergillusnigerSZ-357,由发酵与酶工程研究室分离。2.2实验试剂糊精、酵母膏、氯化镀、磷酸二氢钾、CaCb、酪蛋白、酪氨酸、20%三氯乙酸，3,5■二硝基水杨酸(DNS)o2.3实验设备DHP-9082电热恒温培养箱；2112型恒温摇床；GL-20G-II高速冷冻离心机;BIOTECH-5BG发酵罐，静音无油空气压缩机、BILO
2、N-T-501低温冷却液循环系统；722S型分光光度仪；SW-CJ-2FD型净化工作台；HZS-H超级恒温水浴锅；Sartorius分析天平。三、角蛋白酶液态发酵实验3.1工艺流程菌种活化发酵罐液态发酵(1)发酵罐清洗、空消。(2)pH电极的校正，溶氧电极零占校正。(3)培窯基配制、灭菌。(4)发酵罐降温冷却、通气、溶氧电极斜率校正。(5)发酵参数设置、发酵琏接种。(6)发酵结束、发酵罐清洗。3.2培养基及培养条件3.2.1种子培养基及培养条件(1)液体种子培养基及培养条件：糊精1%,酵母膏4%,氯化钱3%,KH
3、2PO40.03%,CaCl20.5%,pH7.0,121°C灭菌15min。将斜面菌种接种于含有100mL种子培养液的500mL三角摇瓶中，在34°C,180r/min的恒温摇床中振荡培养24ho(2)轶皮固体种子培养基及培养条件：将斜而菌种接种于含水90%的获皮固体培养基屮，34°C,静置培养72h,取岀秋皮种子40°C烘干备用。3.2.2发酵培养基及培养方法发酵培养基：糊精1%,酵母膏4%,氯化钱3%,KH2PO40.03%,CaCl20.5%,pH7.0。培养基121°C灭菌20min,将种子液按5%(联
4、皮种子按3%。)的接种量接种于发酵罐中，在34°C,500r/min的条件下发酵72h。3.3检测方法3.3.1菌体浓度的测定干重法。3.3.2还原糖的测定釆用3,5■二硝基水杨酸(DNS)法测定发酵液屮还原糖含量。(1)标准曲线的绘制：配制1.0mg/mL葡萄糖标准溶液，取9支洁净的25mL比色管编号，按表1加入试剂。向9支比色管中加入0.5mLDNS,摇匀，于沸水浴屮加热5min,取出置于自来水屮冷却，加入4mL蒸镭水，以管“1”为空口在540nm波长处测定OD值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线
5、。(2)发酵液中还原糖含量的测定：取0.5mL待测样于比色管中，再加入0.5mLDNS；在沸水浴屮加热5min,然后冷却；最后加入4mL蒸憎水，540nm下测定OD值。结合标准曲线计算发酵液中还原糖含量。表1匍萄糖标准曲线的制作管号匍甸糖溶液/mL蒸f留水/mL最终浓度/(mg/mL)10().5020.050.450.130.10.40.240」50.350.350.20.30.460.250.250.570.30.20.680.350.150.790.40」0.83.3.3酸性蛋白酶活力的测定Folin■酚法
6、。16周实验日程安排1、6.11日（周日）种子培养基的准备（1）固体麦夫皮种子：实验室研究生事先准备（2）液体种子：周日9:00接种，研究生事先准备。2、6.12H（周一）（1）下午14:30：实验准备、种子培养基、发酵培养基的配制（2）发酵罐操作、电极校正现场培训（第一组15:30；第二组16:30）3、6.13日（周二）（1）9:00发酵罐接种培养（两组同时进行）（2）安排同学值班，每8h取样一次（3）大肠杆菌质粒提取、酶切、电泳3、6.14日（周三）（1）取样分析检测各项指标（2）安排同学值班4、6.15日
7、（周四）（1）取样分析检测各项指标（2）安排同学值班、测酶活试剂准备5、6.16S（周五）（1）9:00上罐结束，完成清洁卫生（2）完成发酵各项参数的测定需要准备的材料:1.种子培养基:液体，4瓶（50mL/500mL）；固体，25g（干重）2.发酵培养基：3.5L3.发酵罐灭电极校正：牛皮纸、棉线、无水亚硫酸钠、pH缓冲液、打火机、酒精、相关药品试剂等。酸性蛋白酶发酵实验值班表（第一组）组长：联系电话:小组成员：日期值班人签字设备运行情况取样时间取样人签字6月13日（星期二）9:00接种全体组员(0h)9:00
8、9:00-21:00(8h)17:0021:00-8:00(夜班)(16h)1:006月14日（星期三）8:00-21:00(24h)9:00(32h)17:0021:00-8:00(夜班)(40h)1:006月15日（星期四）8:00-21:00(48h)9:00(56h)17:0021:00-8:00(夜班)(64h)1:006月16日（星期五）8:00-9:00全体
