2011年基因工程大实验讲义

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1、各位同学：本学期的植物基因工程实验定于第十一周的周一至周六（10.31-11.5日）在综合楼513室进行。望各位同学提前打印好实验讲义，并在每次实验之前对相应实验内容做好充分预习。（实验讲义内容及日程安排见网络教学平台。用户名2009chenshihua密码：123具体实验试验内容如下：大实验一目的基因的克隆（共计8学时）实验一Trizol试剂快速提取植物总RNA（4学时）实验二反转录PCR（4学时）实验三目的基因的PCR扩增（中间穿插准备下次实验相关材料）（4学时）大实验二表达载体的构建（共计

2、24学时）实验一琼脂糖凝胶电泳检测、PCR扩增基因产物的回收及重组载体的构建（4学时）实验二大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（4学时）实验三质粒（重组载体）转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选（4学时）实验四质粒（碱法）提取及电泳检测（4学时）实验五重组载体（质粒）的酶切和电泳检测（4学时）大实验三目的基因的遗传转化及分子筛选/检测（共计16学时）实验一植物转基因操作：渗透法转化拟南芥及转化子筛选（4学时）实验二植物基因组DNA的提取及电泳检测（4学时）实验三转基因植物的PCR检测（及转基因

3、动植物相关检测方法介绍）（4学时）实验四β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植物（4学时）基因工程综合实验具体日程安排：周一上午：总RNA（Trizol试剂）快速提取周一下午：RNA电泳检测及反转录PCR周二上午：目的基因的PCR扩增（中间穿插准备后面实验用的LB培养基）周二下午：琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR扩增基因产物及重组载体的构建周三上午：大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）周三下午：质粒（重组载体）转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选周四上午：植物基因组DNA的提取及电泳

4、检测周四下午：转基因植物的PCR检测（及转基因动植物相关检测方法介绍）周五上午：质粒（碱法）提取及电泳检测周五下午：重组载体（质粒）的酶切及电泳检测周六上午：植物转基因操作技术：渗透法转化拟南芥及转化子筛选周六下午：β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植物目录实验一Trizol试剂快速提取植物总RNA实验二反转录PCR（RT-PCR）实验三琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（DNA）实验四从琼脂糖凝胶中回收（PCR产物）DNA片段实验五DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA）实验六

5、大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）及活性检测实验七质粒转化实验八、九质粒（碱法）提取及重组质粒（重组子）的筛选和酶切检测实验十渗透法转化拟南芥及转化子筛选实验十一植物基因组DNA的提取及转基因植物PCR检测实验十二转基因植物的PCR检测实验一Trizol试剂快速提取植物总RNA实验目的学习用试剂盒从植物组织中提取总RNA的方法。实验原理RNA是一类极易降解的分子，要获得完整的RNA必须在提取过程中最大限度地抑制内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解作用。高强度变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破

6、坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA，蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA，LiCl可以选择性的沉淀RNA，使RNA进一步得到纯化。TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有

7、机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。焦碳酸二乙酯（DEPC）：一种高活性的烷化剂，通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏RNase活性。因此常用于灭活缓冲液和玻璃器皿中的RNase。抑制RNase的活性：准备溶液时使用无RNase的玻璃器皿、DEPC处理过的水。180-300℃烘烤玻璃器皿4小时。用DEPC或其他商业化产品处理塑料制品。尽量使用无RNase的一次性移液器头和微量离心管。在从原包装取出这些小器具时最好使用无菌的镊子！在分离RNA

8、的过程中用抑制剂抑制RNase的活性。实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.低温离心机2.200℃以上烘箱3.琼脂糖凝胶电泳系统4.紫外线透射仪5.高压灭菌锅6.恒温水浴锅7.陶瓷研钵1.微量移液器（二）材料1.新鲜植物组织2.1.5mlEppendorf离心管3.剪刀、一次性手套等（一）试剂1.Trizol试剂2.氯仿3.异丙醇4.70%乙醇5.焦碳酸二乙酯（DEPC）实验步骤1.称取100mg新鲜植物植株，液氮研磨成粉末移入DEPC处理并灭菌的1.5mlEppendorf离心管。2.加入1mlT