生物技术大实验指导（植物基因工程方向）

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1、生物技术大实验实验指导（植物基因工程方向）张汉尧编写西南林学院生物技术教研室二00五年十月生物技术大实验规则生物技术大实验是教学的重要环节,是培养学生动手能力的必要措施。为确保实验的顺利进行。以下规则，请大家共同遵守。一、不得无故迟到、缺席、早退。二、保持安静，精心操作，认真实习。三、讲究卫生，严禁吸烟，药品废物不乱丢乱倒。四、注意节约，不随意浪费药品及试材。五、爱护公物，使用仪器，用前检查，用后归还，用完的玻璃器皿应及时清洗。六、注意安全。使用电器要特别小心谨慎；离开实验室要关好水电门窗。目录前言11实验

2、目的12实验内容13实验流程24材料34.1仪器与用品34.2试剂34.3材料64.3.1菌株和质粒64.3.2植物材料64.3.3生化试剂与寡核苷酸引物64.3.4引物64.4步骤与方法74.4.1拟南芥叶片组织培养74.4.1.1培养基的配制74.4.1.2接种74.4.2大肠杆菌感受态的制备及转化84.4.3质粒的小量提取94.4.4质粒的酶切检测104.4.5土壤根癌杆菌感受态的制备（CaCl2）及转化104.4.6PCR挑选转化子114.4.7琼脂糖凝胶电泳检测124.4.8菌种保存134.4.9

3、叶盘法转化拟南芥134.4.10植物DNA的小量提取144.4.11转基因植物的PCR检测155作业17前言在迄今发展起来的转基因技术中，农杆菌介导的遗传转化占据主导地位，应用最为广泛，特别是在双子叶植物上尤其普遍。近几年来农杆菌转化在水稻等谷类作物上取得成功，其应用范围将进一步扩大。农杆菌介导的优点是转化频率高，可转移较大的DNA片段，所转移DNA很明确地为T-DNA左右边界之间的序列，并可直接用不同的植物组织进行基因转移，不需要原生质体培养再生植株的技术，从而提高转育周期。拟南芥是一种十字花科植物，广泛

4、用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于这种植物具有以下特点：（1）形态个体小，高度只有3Ocm左右；（2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6周左右；（3）种子多，每株每代可产生数千粒种子；（4）形态特征简单；（5）基因组小，只有5对染色体。本实验以拟南芥为受体材料以根癌农杆菌为介导，实现外源基因的导入。使学生掌握目前使用最为普遍的农杆菌介导外源基因导入植物的方法。1、实验目的：把生物技术基因工程方向专业基础课、专业课的实验联系起来，从而使学生对植物基因工程

5、的操作技术有初步的、整体的感性认识，掌握目前使用最为普遍的农杆菌介导外源基因导入植物的方法，并达到理论联系实际、理论指导实践的目的。2、实验内容：1）组织培养；2）质粒转化大肠农杆菌；3）质粒提取；4）酶切检测；5）质粒转化根癌农杆菌；6）PCR挑选转化子；7）植物基因组DNA提取。8）PCR检测。3、实验流程：表达载体的构建（用基因工程操作中所得的结果）转化大肠农杆菌（DH/5α）提取质粒酶切检测转化根癌农杆菌(LBA4404)拟南芥培养PCR检测取外植体转化拟南芥外植体组织培养获得再生植株提取植物DNA

6、PCR检测4材料4.1仪器与用品冷冻高速离心机、恒温摇床、低温冰箱、超净工作台、电泳仪、PCR仪、鼓风干燥箱、高压湿热灭菌锅、电光分析天平（感量为0.0001g）、杂交仪、PH计、移液枪、枪头（200ul、1ml、5ml）、1.5ml离心管、500ml三角瓶、量筒（20ml、50ml、100ml）、牙签、培养皿、烧杯（50ml、100ml、500ml）、容量瓶、三角瓶、镊子、手术刀、药勺、玻璃棒、透气封口膜、橡皮圈、酒精灯。4.2试剂1、CellLysisSolution：0.2mol/LNaOH1%SDS

7、2、CellResuspensionSolution：50mmol/LTris-HCl(PH=7.5)10mmol/LEDTA100ug/mlRNase3、NeutraliztionSolution：1.32mol/LNaAc(PH=4.8)4、LB液体培养基：蛋白胨10g/L酵母浸膏5g/LNaCl10g/L5、YEB液体培养基：蛋白胨5g/L酵母浸膏1g/L牛肉浸膏5g/LMgSO4‐7H2O0.493g/L6、大量元素母液配方（母液Ⅰ）NH4NO333000mg/LKNO338000mg/LCaCl2

8、.2H2O8800mg/LMgSO4.7H2O7400mg/LKH2PO43400mg/L7、微量元素母液配方（母液Ⅱ）KI166mg/LH3BO31240mg/LMnSO4.4H2O4450mg/LZnSO4.7H2O1720mg/LNa2MoO4.2H2O50mg/LCuSO4.5H2O5mg/LCoCl2.6H2O5mg/L8、铁盐母液配方（母液Ⅲ）FeSO4.7H2O5560mg/LNa2.EDTA.2H