植物生物技术实验指导

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1、目录实验一培养基母液的配制1实验二培养基的配制4实验三愈伤组织诱导及培养6实验四愈伤组织继代培养7实验五植物生长调节剂对愈伤组织形态发生的作用8实验六植物人工种子的制备9实验七茎尖培养11实验八细胞液体悬浮培养12实验九低温和饥饿处理诱导悬浮培养细胞同步化14实验十花药培养16实验十一成熟胚的培养17实验十二叶肉原生质体的分离与培养18实验十三悬浮培养细胞原生质体的分离与培养20实验十四PEG诱导原生质体融合22实验十五三亲本杂交法转化农杆菌24实验十六冻融法转化农杆菌26实验十七基因枪法转化愈伤组织27实验十八农杆菌介导法转化水稻愈伤组织30实验十九转化愈伤的除菌、筛选及再生

2、32实验二十植物总DNA的提取35实验二十一植物总RNA的提取37实验二十二转化植株的PCR检测38实验二十三组织化学染色法检测Gus活性41实验二十四转化植株的Southern检测43实验二十五转化植株的Northern检测4749实验一培养基母液的配制一、实验特点实验类型：验证实验类别：专业计划学时：3每组人数：2二、实验目的要求掌握配制培养基母液的原理；学习培养基母液的配制方法和母液的使用方法。三、实验原理在植物组织培养所用的培养基中，一般都含有无机盐、有机物和植物生长调节剂等十几种成分。如果每次配制培养基时都按着成分表逐个地称量，不但费时，而且有些成分的用量极小，配制时

3、容易产生误差。因此，为了提高工作效率和减少误差，一般将常用的基本培养基中的各种成分配成一定倍数的贮存液，这种溶液叫培养基母液。用时，根据培养基配方、母液浓度和要配制的培养基的体积计算出所需溶液的体积，用量筒、移液管或微量移液器量取即可。母液的配制有2种方法：单配法和混配法。前者便于配制不同种类的培养基，后者便于大量配制同种培养基。（1）单配法：将培养基配方中的每个组分配成一定浓度单一化合物母液，这种母液的浓度一般用mg/mL表示。本实验配以下母液：无机盐称取量（mg）定容体积（mL）浓度（mg/mL）Na2MoO42H2O501000.5CuSO4·5H2O501000.5Co

4、Cl2·6H2O501000.5烟酸1001000.5VB11001000.5VB61001000.5（2）混配法：将培养基配方中的组分配成几种不同的混合溶液，将各类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起，定容到一定体积，配成混合母液。如MS基本培养基中的营养成分可配成A、B、C、D、E、F六类母液。这种母液的浓度可用a倍表示。其意义为：母液中各成分的浓度是培养基中该成分浓度的a倍，配制1升培养基需吸取该母液1000/a毫升。本实验以MS培养基为例，学习培养基母液的配制方法及母液的使用方法。四、实验仪器设备49天平（万分之一，百分之一）、药匙、试剂瓶

5、（500mL、200mL）、容量瓶（500mL、200mL、100mL）烧杯（500mL、100mL），玻璃棒，电炉、标签纸五、材料消耗费本实验需材料消耗费50元/组，具体消耗品如下：MS基本配给药品、2，4-D、NAA、IBA、IAA、BA、蒸馏水、KT、95%酒精、1N盐酸六、实验内容步骤1．MS无机盐母液的配制A：50倍500mL(1)蒸馏水350mL(2)NH4NO341.25g(3)KNO347.5g取约350mL蒸馏水于烧杯中，依次加入（2）（3），待（2）（3）全溶后定容至500mL，装入广口瓶，注明母液名称、浓度、日期，4℃冰箱中贮存备用。B：100倍500mL

6、(1)蒸馏水350mL(2)MgSO4·7H2O18.5g(3)MnSO4·4H2O1.115g或MnSO4·H2O0.845g(4)ZnSO4·7H2O0.43g(5)CuSO4·5H2O1.25mg（2）~（5）依次溶解后定容至500mL。（其他同A）C：100倍500mL（1）蒸馏水350mL（2）CaCl2·2H2O22g或CaCl216.61g（3）CoCl2·6H2O1.25mg（4）KI41.5mg（2）~（4）依次溶解后定容至500mL。（其他同A）D：100倍500mL（1）蒸馏水350mL（2）KH2PO48.5g（3）H3BO30.31g（4）Na2MoO

7、4·2H2O12.5mg（2）~（4）依次溶解后定容至500mL。（其他同A）E：100倍500mL（1）蒸馏水350mL49（2）Na2-EDTA1.865g（3）FeSO4·7H2O1.39g在盛有350mL蒸馏水的烧杯中加入2粒氢氧化钠，溶解后加入Na2-EDTA，加热使其全部溶解。然后边搅拌，边慢慢加入FeSO4·7H2O直至全部溶解。冷却后定容至500mL，装入棕色试剂瓶中，注明名称、浓度、日期，4℃保存备用。2．MS有机物母液的配制F：200倍100mL（1）肌醇2g（2）烟酸1