基因工程实验

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1、实验一实验计划表一、实验目的１、了解本学期整体的实验流程及安排。２、熟练使用微量移液器。３、学习制备琼脂糖凝胶二、实验原理1.基因工程（GeneEngineering）又称ＤＮＡ重组技术，把不同生物的ＤＮＡ与载体相连，并导入到受体细胞中去增殖、表达。2.基因工程包括切、接、转、增、检五大要素。三、实验用具及试剂凝胶电泳系统、微量移液器、三角瓶、微波炉、铲子、手套、琼脂糖、1×TBE、加样缓冲液四、实验操作1.本学期实验计划⑴目的基因的获取　　　基因组总ＤＮＡ提取→凝胶电泳检测→ＰＣＲ扩增目的基因→ＰＣＲ产物的电泳检测→ＰＣＲ产物纯化→获得目的基因ITS⑵ＤＮＡ重组、转化　　

2、　ITS与pMD18-T连接→DH5a感受态细胞制备→转化、平板涂布、培养⑶筛选与鉴定　　　抗生素抗性筛选→挑单菌落培养→提取质粒→质粒酶切、电泳检测　　2.微量移液器的使用⑴使用操作•将微量移液器按钮轻轻压在第一挡•垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部•缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。•等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过•平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、•提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过•然后按吸头弹射器除去吸头⑵使用注意事项•

3、未装吸头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。•一定要再允许范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。•不要横放带有残留液体吸头的移液器•不要用大量程的移液器移取小体积样品•微量移液器每日用完后，应旋转到最大刻度，让弹簧恢复原形，保持弹性。•为了确保微量移液器的准确性，移液器必须定期进行校准。3.琼脂糖凝胶制作•选择好胶盒、胶板和梳子，洗净，把胶板放入胶盒中，梳子插上。•量取25ml1×TBE溶液放入锥形瓶或烧杯中•称量0.25g琼脂糖，倒入锥形瓶中•将锥形瓶放入微波炉中，让溶液沸腾2-3次，琼脂糖彻底融化•锥形瓶取出，稍稍冷却后倒入胶盒中•

4、等待琼脂糖冷却凝固形成点样孔后即可实验二　基因组总ＤＮＡ提取一、实验目的掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。二、实验原理CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来，再加入氯仿等有机溶剂，使蛋白质变性，去除脂类物质，使DNA有利于水相中。在水相中加入无水乙醇或异丙醇，沉淀DNA，将沉淀的DNA溶于TE溶液，即得植物总DNA溶液。三、实验用具与试剂微量移液器、高速离心机、1.5mlＥＰ管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱，、化缓冲液:TE 、EDTA、NaCl、CTAB、氯仿:异戊醇(24

5、:1)，无水乙醇，70%乙醇四、实验步骤１、取适当的植物叶片快速研磨，研磨后粉末装于1.5mlEP管中。２、加入500ul预热的CTAB缓冲液，置于65℃水浴锅中，水浴45min。３、水浴结束后，5000rpm5min，把上清液转移至另一支干净的1.5mlEP管中。4、加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），上下颠倒混匀，12000rpm10min，留上清，将上清液吸至另一支干净的1.5mlEP管中。５、加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀30min。６、12000rpm10min，留沉淀。加入75%乙醇洗两次，每次12000rpm10min，留沉淀。７、放入50℃烘箱

6、中5-10min干燥沉淀，干燥完毕后加入30ulTE或ddH2O溶解沉淀，即为所得的植物总DNA。８、制1%琼脂糖凝胶检测提取效果。五、思考题提取染色体ＤＮＡ的基本原理是什么？操作中应该注意什么？实验三　ＰＣＲ扩增一、实验目的１、学习ＰＣＲ扩增的基本原理。２、掌握ＰＣＲ技术的常规操作。３、了解ＰＣＲ扩增的参数设计。二、实验原理１、聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段的过程。２、ＰＣＲ反应体系　　引物、dNTP、Mg２＋、模板、TaqDNA聚合酶，Buf

7、fer。３、ＰＣＲ循环参数①9５℃5min②9５℃30s③5２℃30s④72℃30s⑤goto②２９times⑥72℃10min三、实验用具与试剂旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统，TaqDNA聚合酶，PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液四、实验步骤１、在0.2mlPCR微量离心管中配制30ul反应体系。　　　　ddwater　　　　　　　　20.5ul10×PCRb