基因工程实验指导

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1、实验一大肠杆菌感受态的制备及转化1. 实验目的通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA 转入受体细胞的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2. 实验原理转化（transformation）：是将异源 DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA 分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。自

2、然界中多数细菌的转化频率较低，如大肠杆菌等。但受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cells) 。在一定条件下，将带有外源DNA的载体分子与感受态细胞混合，可以使载体 DNA分子进入受体细胞。常用的转化方法主要有以下两种：1）化学法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体 DNA分子导入受体细胞；2）电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的

3、作用将载体 DNA分子导入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化的细胞在选择培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带有异源 DNA分子的受体细胞。本实验以 E.coliDH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与 pUC19 质粒共保温，实现转化。pUC19 质粒携带抗氨苄青霉素和 lacZ’基因，因而接受了pUC19 质粒的受体菌具有了抗氨苄青霉素的能力，能在含有amp 的培养基上存活，从而将转化细胞筛选出来。3. 仪器

4、、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温水浴，分光光度计，冷冻离心机，摇床，移液枪，水浴锅试剂：LB培养基（液体、固体）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，调 pH7.0。高压灭菌)1M CaCl2(预冷，过滤除菌)1M MgCl2(预冷)含 amp的固体 LB培养基（琼脂浓度15g/L）冰块若干材料：大肠杆菌菌株：E.coli DH5α质粒：pUC191 耗材：带盖离心管(预冷)，枪头(预冷)，PE 手套4. 操作步骤4.1 感受态的制备1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中

5、，37℃振荡培养 12h左右，至对数生长期。将该菌悬液以 1:100～1:50 转接于 100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min 测一次OD600，至OD600≤0.5 时停止培养。2）在无菌条件下将细菌转移到一个冰预冷的无菌50mL离心管中，冰上放置10min，使培养液冷却至 0°C。（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快）3）4°C 2500×g离心 5min，倒尽培养液，回收细胞。4）用 20mL（原体积的 1/5）无菌冰预冷的 0.1mmol/L MgCl2悬浮细胞，4°

6、C 2500×g 离心 5min，倒尽培养液，回收细胞。5）50mL 无菌冰预冷的0.1mmol/LCaCl2悬浮细胞，冰上放置20min，4°C2500×g 离心 4min，倒尽培养液，回收细胞。6）10mL无菌冰预冷的 0.1mmol/L CaCl2重悬浮细胞。可 4°C存放 12－24hrs，或加入 1mL无菌甘油，分装于 1.5mL离心管中，70°C可保存半年至一年。4.2 细胞转化1）准备LB/ampicillin/IPTG/Xgal 固体培养基。（每板涂200mg/mL 的IPTG 和20mg/mL的 XGal 各 40μL，

7、室温下放置 23hr）2）在 1.5mL 离心管中加入 2μL连接产物，其中一管加入 2μL水作为对照。3）从70°C冰柜中取出感受态细胞，冰浴中融化。4）将感受态细胞轻轻混匀，取 4050μL与连接产物混合。冰浴中放置 20min。5）控制水浴温度恰好为42°C，热击 7590sec，然后迅速转移至冰浴 2min。6）加入 950μLLB液体培养基（不含ampicillin），37°C摇床震荡培养 1.5hrs。使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。7）8,000rpm离心 1min，除去上清液。沉淀用10

8、0μL LB回溶。8）将100μL 菌液涂于培养基上（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫），菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(1216小时)