基因工程大实验开题归纳总结报告.doc

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1、学号内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室本科基因工程大实验开题报告论文题目：纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达学生姓名：年级：专业：指导教师：年月日6学生姓名民族性别出生年月论文题目纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达开题时间结题时间项目来源本科生基因工程大实验课一、立论依据“纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达”项目的选题和研究的意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处：纳豆是日本传统的发酵食品，日本民间有“纳豆可以在一定程度上预防并治疗心血管疾病”的说法。后经研究发现,纳豆含有丰富的生理活性物质,具有抗

2、血栓、降血压、预防癌症等多种显著的生理调节功能,越来越受到世界各国的重视[1]。纳豆激酶（nattokinase，NK）是一种枯草杆菌蛋白激酶，也是具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。1987年由日本的须见洋行等首先发现，由于其具有无毒无副作用，体内半衰期长，成本低廉等其它溶栓剂无法比拟的优点，极有可能成为新一代抗栓药物[2]。研究发现，纳豆激酶能显著地溶解体内外血栓，明显缩短优球蛋白溶解时间，并能激活体内血管内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)，从而增加内源性纤溶酶的量与作用，间接表现溶栓活性[3-5]。今后20年,我国将步入老龄化社会,血栓病是中老年人的

3、高发病,是死亡威胁最大的疾病之一。现在使用的溶栓药物链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂等，在临床使用过程中存在稳定性差、药效短、易引起患者全身性出血等副作用，并且有半衰期短、来源短缺、成本高等缺点[6-7]。而纳豆激酶来源于传统发酵食品,生产工艺简单,无副作用,安全性高,符合治疗血栓病的药品或食品基料的要求。它的溶栓功效已得到各方认可。在日本、美国、韩国和朝鲜等国家都有大公司生产出多种以纳豆激酶为主要成分的产品,此外,我国在实施药品专利保护和知识产权保护后,新药的仿制将受到严格限制。因此研制新溶栓药物具有紧迫性。虽然国内外许多学者热衷于纳豆激酶的研究,渴望

4、将其开发成为新一代的溶栓新药,但目前仍存在不足之处,如还未开发出纳豆激酶针剂等。而社会对高效、廉价的溶血栓类药物的开发要求非常迫切,因此纳豆激酶所具有的许多良好的生理调节功能和特殊的溶血栓活性使其成为了一种预防和治疗血栓及栓塞性疾病的理想药物,具有广泛的开发前景[8-10]。6参考文献[1]SumiH,HamadaH,TsushimaH,etal.Experientia,1987,43(10):1110-1111.[2]余榕捷,谢秋玲,洪岸,等.中国病理生理杂志,2003,19(6):757-761.[3]NakamuraT,YamagataY,Ichish

5、imaE.BiosciBiotechBiochem,1992,56(11):1869-1871.[4]罗立新,黄志立,凌均建,等.华南理工大学学报,2002,29(4):59-62.[5]SCHUBERTM,PETERSSONUA,HAASBJ,eta.lProteomemapofthechloroplastlumenofArabidopsisthaliana[J].JBiolChem,2002,277(10):8354-8365.[6]张锋,金杰.西北农业学报,2005,14(3):159-162.[7]LINDERMAYRC,DURNERJ.S-Nitr

6、osylationinplants:patternandfunction[J].JProteomics,2009,73(1):1-9.[8]张淑梅,张云湖,赵云祥,等.中国生物化学与分子生物学报,1999,15(6):912-915.[9]孙立娜.工企医刊,2008,21(2):57-60.[10]付利,杨志兴.纳豆激酶的研究与应用.生物工程进展,1995.6二、实验方案1．实验内容和实验目标，拟解决的关键问题：1.1实验内容：①、NK的PCR扩增。②、PCR产物与pMD-19-T的连接。③、pET-trx与NK构建表达载体。④、转化E.coliBL21(D

7、E3)，IPTG诱导表达⑤、SDS-PAGE检测并观察。1.2实验目标：①、学习如何进行一个项目的前期准备工作，策划、论证等。②、通过实验培养将书本知识转化为实际操作的能力。③、培养良好的实验习惯，如记录实验数据，反思实验操作，解决实验问题。1.3拟解决的关键问题：①、目的基因的克隆和酶切。②、如何构建正确的过渡和表达载体。③、如何利用SDS-PAGE检测表达蛋白。2．实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析：2.1实验思路及方法PCR克隆pMD18-T-NK克隆质粒上的纳豆激酶基因，将其与pMD19-T载体连接，转入DH5α感受态细胞筛选鉴定，然后用

8、双酶（BamHI/EcoRI）切下相应基因片段，插入