南蛇藤提取物靶向mTOR促进人肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制研究

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1、分类号学号Ｍｌ５０８２９ＵＤＣ密级＠螓叫大聲ＹＡＮＧＺＨＯＵＵＮＩＴＩＶＥＲＳＹ硕士学位於文（学术型）南蛇藤提取物靶向ｍＴ〇Ｒ促进人肝癌ＨｅｐＧ２细胞凋亡的分子机制研究杨奸指导教师姓名：钱亚云副教受，扬州大学，江苏扬州，２２５００９申请学位级别：硕士学科专业名称：中西医结合临床论文提交日期：２０丨８年４月５日论文答辩曰期：２０１８年６月１曰学位授予单位：扬州大学学位授予日期：２０１８年６月３０曰答辩委员会主席：齐炼文教授２０１８年６月南蛇藤提取物靶向ｍＴＯＲ促进人肝癌ＨｅｐＧ２细胞凋亡的分子机制

2、研究ＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｔｈｅＣｅｌａｓｔｒｕｓＯｒｂｉｃｕｌａｔｕｓｅｘｔｒａｃｔｓｉｎｄｕｃｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇｍＴＯＲｉｎｈｕｍａｎｈｅａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａＨｅＧ２ｃｅｌｌｓｐｐ基金项目：国家自然科学基金（ＮＯ．８１４０３２３２）国家自然科学基金（ＮＯ．８１５７３６５６）国家自然科学基金（Ｎ０．８１７７３９４４）江苏省自然科学基金（ＮＯ．ＢＫ２０１７１２９０）、、扬＾１１大学２０１８年６月杨婷南蛇藤提取物靶向ｍＴＯＲ促进人肝癌ＨｅｐＧ２细胞

3、凋亡的分子机制研究１南蛇藤提取物靶向ｍＴＯＲ促进人肝癌ＨｅｐＧ２细胞凋亡的分子机制研究硕士研究生：杨婷导师：钱亚云副教授中文摘要中草药南蛇藤，，，卫矛科南蛇藤属药性辛温，有小毒具有祛风、活血、解毒、消肿等功能。课题组前期研宄发现，南蛇藤提取物（Ｃｅ／ｆｌ你ＯｒＷｃｗｔｏｗｅｘｔｒａｃｔｓ，ＣＯＥ）具有较强的抗肿瘤活性，能抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡，但其分子机制还未完全明确。原发性肝癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ），消化道最常见的恶性肿瘤一上升趋势之，致死率在所有癌症中居第三位。目前采取以，近年来发

4、病率呈。手术切除为主的综合治疗模式，但是愈后不佳哺乳动物雷帕霉素耙蛋白（ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ参与多）种生理与病理过程，是细胞内许多重要信号转导通路的关键枢纽，其功能失调与肿瘤的发生发展紧密相关。为了研宄南蛇藤提取物是否靶向ｍＴＯＲ发挥抗肿瘤活性，本文构建了过表＋达ｍＴＯＲ基因的人肝癌ＨｅｐＧ２细胞株（记作ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ细胞），加入不同浓度的南蛇藤提取物干预后，探讨ＣＯＥ对人肝癌ＨｅｐＧ２细胞增殖及凋亡的影一响及机制，，。结果显示与对照组相比在定浓度范围内，ＣＯＥ呈浓度依赖性地减少ｍＴＯＲ的表达，抑制人肝

5、癌ＨｅｐＧ２细胞的增殖，促进人肝癌ＨｅｐＧ２细胞凋亡，其分子机制可能与南蛇藤提取物抑制ｍＴＯＲ相关信号转导通路有关。本研宂内容共分四部分。２扬州大学硕士学位论文第一部分＋人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ细胞株的构建目的：构建过表达ｍＴＯＲ蛋白的人肝癌ＨｅｐＧ２细胞株。－方法：体外培养人肝癌ＨｅｐＧ２细胞株至对数期，利用分子生物学技术，将ＧＶ２３８ｍＴＯＲ重组质粒转染至人肝癌ＨｅｐＧ２细胞中，同时设阴性对照组和野生细胞对照组。２４ｈ后，倒置显微镜下观察细胞形态。收集细胞总蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测人肝癌ＨｅＧ２细胞中ｐｍＴＯＲ蛋白的表达量。

6、结果，：转染２４ｈ后，倒置显微镜下观察野生型细胞贴壁生长，呈梭形，细胞轮廓清＋晰，细胞壁光滑无突起，折光性良好，核质均匀。与之相比，大部分ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ细胞＋形态无显著变化，少量细胞变圆。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，与对照组相比，ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ细胞中ｍＴＯＲ蛋白的表达水平显著增加。＋结论：成功构建了人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ细胞株。ｍＴＯＲ关键词：；质粒转染；过表达；肝癌第二部分＋南蛇藤提取物对人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ细胞的影响＋目的：研究南蛇藤提取物ｅｘｔｒａｃｔｓ，ＣＯＥ）对人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ细胞增殖、凋亡、侵袭及迁

7、移能力的影响。＋方法：对数期人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ细胞，加入不同浓度的ＣＯＥ（２０，４０，８０，１６０，３２０ｍｇ／Ｌ），以野生型细胞为阴性对照，２ｍｇ／ＬＤＤＰ为阳性对照。ＭＴＴ法检测各组药物对人＋肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ细胞增殖能力的影响；倒置显微镜及透射电镜观察形态学改变；流式细＋胞术检测药物对人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ细胞凋亡的影响；细胞划痕法检测药物对人肝癌＋ＨｅＧ２／ｍＴＯＲ细胞爬行能力的影