萝卜硫素通过调控CD8_ T细胞功能发挥抗肿瘤效应的研究

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1、学校代码10459学号或申请号密级公开专业硕士学位论文萝卜硫素通过调控CD8+T细胞功能发挥抗肿瘤效应的研究作者姓名：李红导师姓名：吕全军教授张毅教授专业学位名称：营养与食品卫生学培养院系：公共卫生学院完成时间：2018年11月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterSulforaphaneexhibitsantitumoreffectbyregulatingthefunctionsofCD8+TcellsBy:HongLiSupervisor:Prof.QuanjunLv,YiZhangNutr

2、itionandFoodHygieneCollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversityNovember,2018原创性声明立进行研本人郑重声明，是，独：所呈交的学位论文本人在导师的指导下究所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研宄作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。ｄ学位论文作者：曰期：％Ａ年月曰学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大

3、学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州、大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学一位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：曰期：丨年丨月曰摘要目的恶性肿瘤严重威胁人类健康，是迫切需要解决的公共健康问题。大多数常见恶性肿瘤的预后仍很差，从天然化合物（特别是膳食成分）中寻找安全、有效的抗

4、肿瘤药物是肿瘤治疗领域的研究热点。萝卜硫素是异硫氰酸盐类化合物，被认为是抗肿瘤效果最好的植物活性成分，主要存在于西兰花、卷心菜等十字花科蔬菜。研究表明，萝卜硫素通过不同的分子机制对癌症发生的多个阶段均有抑制作用。流行病学研究也显示常吃西兰花等十字花科蔬菜有助于预防癌症。机体免疫系统在抗肿瘤中发挥重要作用，但萝卜硫素是否通过调控免疫系统发挥抗肿瘤作用尚不清楚。近年来，嵌合抗原受体（chimericantigenreceptor，CAR）T细胞等新型免疫治疗技术治疗肿瘤取得了突破性进展，证实CD8+T细胞在机体抗肿瘤的关键作用。本课题中，我们拟在体外实验中探索萝卜硫素对CD

5、8+T细胞表型、功能和分化的影响；并利用识别肿瘤抗原HER2的CART（HER2-CART）细胞，在体外和小鼠模型中验证萝卜硫素对HER2-CART细胞抗肿瘤作用的影响及机制。本研究有助于揭示萝卜硫素抑制肿瘤的新机制，可能为肿瘤免疫治疗提供新手段。方法收集健康志愿者的外周血，分离单个核细胞、用免疫磁珠纯化CD8+T细胞。用抗CD3/CD28抗体偶联磁珠在体外活化CD8+T细胞，并分别加入不同浓度的萝卜硫素培养3天；利用流式细胞仪检测CD8+T细胞表面共刺激分子；利用细胞内因子染色分析CD8+T细胞分泌的细胞因子；利用Annexin-V/PI染色检测CD8+T细胞的凋亡，

6、通过定量PCR检测抗凋亡基因；利用流式细胞仪分析CD8+T细胞分化表型，通过Westernblot检测AMPK信号通路磷酸化，并利用siRNA抑制mTOR表达。I用流式细胞仪检测人肺癌细胞A549HER2分子的表达及HER2-CART细胞的表型。在体外实验和免疫缺陷小鼠模型中验证萝卜硫素对HER2-CART细胞杀伤A549细胞的影响，并分析CD8+T细胞表型的改变。结果和对照组相比较，萝卜硫素明显下调CD8+T细胞表面抑制性分子PD-1（20.8±2.92%vs11.8±2.32%，P=0.0045）和Tim-3的表达（24.0±4.28%vs14.1±1.38%，P=

7、0.02），但对活化性分子的表达无显著影响；促进CD8+T细胞分泌IFN-γ（14.20±3.06%vs30.2±8.88%，P<0.05）、IL-2（10.7±0.99%vs26.0±6.91%，P<0.05）和TNF-α（14.1±4.18%vs30.6±4.95%，P<0.03）等细胞因子；显著抑制CD8+T细胞凋亡（11.3±2.64%vs5.7±0.78%，P<0.05），上调Bcl-2和Bcl-6等抗凋亡基因的表达；促进CD8+T细胞分化为前体记忆效应细胞[上调CD127（22.8±4.5%vs55.5±8.0%，P=0.00