西兰花离体细胞增殖和萝卜硫素合成代谢调控研究

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文西兰花离体细胞增殖和萝卜硫素合成代谢调控研究ProliferationofBroccoliCellinvitroandMetabolismRegulationofSulforaphane唐斌指导教师姓名李胜教授（甘肃农业大学兰州730070）学科专业名称作物生态生理研究方向植物细胞工程论文答辩日期2015年5月31日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席王鸣刚教授评阅人王新宇教授冯汉青副教授2015年6月甘肃农业大学2015届硕士学位论

2、文摘要利用植物细胞培养技术进行植物次生代谢物质的生产具有独特的优势和广阔的应用前景，发展迅速，结合诱导子对次生代谢物质的调控，提高次生代谢物质的产量，是工厂化生产次生代谢物质的有效途径。西兰花中因富含抗癌活性物质萝卜硫素而受到越来越多关注。本文以西兰花愈伤组织为实验材料，利用植物组织培养技术，考察不同营+-2+2+养元素NH4/NO3不同浓度比例以及不同浓度Ca、Mg对细胞生长及生理生化指标的3+4+影响，不同诱导子SA、SNP、La、Ce对细胞生长及细胞中萝卜硫素合成的影响。另外对NO信号途径

3、介导外源SA促进萝卜硫素合成进行了研究。得到以下主要研究结果：1.不同营养元素对细胞生长及生理生化指标的影响（1）以西兰花植株根、茎、叶为外植体，诱导的愈伤组织生长状态根最好，茎最差。-+（2）NO3/NH4比例为40/20（mmol/L）时，根和叶诱导的愈伤细胞有最大生物量，-+显著高于其他浓度；NO3/NH4比例为45/15（mmol/L）时，茎诱导的愈伤细胞生物量最2+大；Ca浓度分别为1.5、1.5和0.5mmol/L时，根茎叶诱导的愈伤细胞有最大生物量，分别为17.6g/flask、5

4、.5g/flask和10.8g/flask，较CK分别增加10.7%、67%和28.6%；2+Mg浓度分别为1.5、1.0和1.0mmol/L时，根、茎、叶愈伤组织生物量分别较CK增大21.1%、54.8%、13.8%。-+2+2+（3）NO3/NH4比例、Ca、Mg作用于西兰花离体细胞都能引起细胞中PAL活性+的变化，NH4比例增加对不同来源的愈伤组织细胞PAL活性均有显著增强作用，其中茎诱导愈伤变化幅度最大，而根诱导愈伤中变化幅度最小。-+2+2+（4）NO3/NH4比例、Ca、Mg作用于西

5、兰花离体细胞都能引起细胞中SOD、POD以及CAT酶活性发生相应变化，酶活性变化往往与细胞生物量和细胞活力存在相关性，-+当NO3和NH4以特定比例添加至细胞中时，SOD、POD、CAT酶活性降低，而任意一2+2+种比例升高，会导致酶活性升高；过低或过高浓度Ca和Mg处理细胞会导致三种保护酶活性的增强。3+4+2.外源SNP、SA和La、Ce对西兰花离体细胞中萝卜硫素合成的影响（1）外源SA和SNP抑制细胞生长，但可促进萝卜硫素合成。SA和SNP浓度分别为10mg/L和0.1mmol/L时，细胞

6、中萝卜硫素含量分别较CK升高59%和43.4%。La(NO3)3和Ce(NH4)2(NO3)6分别浓度为40mg/L和5mg/L时，细胞生物量增加最显著，较CK增加39.5%和22.5%；La(NO3)3会抑制细胞中萝卜硫素的合成，造成萝卜硫素含I甘肃农业大学2015届硕士学位论文量的显著降低，Ce(NH4)2(NO3)6浓度为20mg/L时，萝卜硫素含量增加最显著，较CK增加51.6%。（2）外源SA、SNP以及La(NO3)3处理细胞会降低萝卜硫素产量，且差异显著。而外源Ce(NH4)2(N

7、O3)6处理细胞会提高萝卜硫素产量，添加5mg/LCe(NH4)2(NO3)6时，萝卜硫素产量较CK提高63.7%，差异显著。3.NO信号途径介导外源SA促进西兰花离体细胞中萝卜硫素生物合成的研究（1）外源SA对细胞内NO积累和SF合成的影响。SA浓度为10mg/L时，NO含量增加幅度最大，为CK的3.34倍，萝卜硫素含量也最高，为CK的1.69倍。（2）外源SA处理细胞后，细胞中NO、SF合成动态表明，NO含量在添加SA12h后达到峰值，为CK的5.0倍；SF含量在添加SA30h后达到峰值，为

8、CK的1.7倍。（3）同时添加NOS和NR专一抑制剂时，细胞中NO含量较CK下降了89.1%；添加NOS专一抑制剂L-NAME（5mmol/L）后，NO较CK下降47.1%，而添加NR专一抑制剂Tungstate（5mmol/L）后，NO较CK下降74.4%。（4）在SA处理细胞之前加入NO抑制剂或清除剂同样会降低细胞中NO的含量，但下降幅度较单独添加NO抑制剂或清除剂时变小，同时SF的含量仍能一定程度增加，但增加幅度较单独添加SA时小；而添加NO供体SNP后会引起NO含量大幅升高，SF含量同样