应用毛细管区带电泳分离分析蛋白质及多肽

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1、文献综述应用毛细管区带电泳分离分析蛋白质及多肽方晓红朱涛孙亦梁*（北京大学化学系，100871）生命科学研究的迅速发展对生物大分子的分离与M2/3/Z(M是分子量,Z是电荷数)成正比，这一结分析提出了更高的要求，促使人们不断研究和开发论对某些多肽也成立[10]Grossman11]研究了40多新型的高效、快速、选择性好的分离分析方法。传统种肽在CZE中的迁移行为，提出CZE中肽迁移率u的电泳技术是目前生物化学及分子生物学实验室中的经验公式：常用的分离分析和制备手段，但它周期长，操作繁u=5.23·10-4·ln(q＋1)/n0.43＋2.47·10-5琐，难以定量和自动

2、化。高效液相色谱法在分析蛋白n是氨基酸残基数，q是净电荷数。质、多肽及核酸等生物大分子时，因样品组分扩散系Deyl1]发现许多蛋白质的CZE相对保留时间数小，传质阻力加大而分离效率较低。与其等电点(pI)值之间有近似的线性关系。高效毛细管电泳(HPCE)，是近十年特别是近Compton[12,13]运用Debye-Hckel-Henry理论，提出三、四年来迅速发展起来的一项新型分离分析技术。蛋白质迁移率u的半经验公式：它将电泳方法与色谱技术相结合[1]，具有高效、快u＝K(1)·Za[K(2)·M1/3＋K(3)*I1/2·M/3]速、分析所需样品量少、易自动化等优越性

3、，在分析其中K(1),K(2),K(3)分别是与蛋白质分子大小，化学各领域都显示了其应用潜力，并且由于它的理形状及介质的性质有关的常数，并进一步研究了蛋论分离柱效与样品组分扩散系数成反比[2]，使它尤白质计算价态（Zc）与实际价态（Za）关系，认为其比其适合于生物大分子的分析。目前应用高效毛细管值为蛋白质分子量、电荷数及溶液离子强度I的函电泳分离分析蛋白质、多肽及核酸等生物大分子的数，Mosher[14]则建立了一个蛋白质电泳行为的数学研究十分活跃。模型，用计算机进行模拟处理。已有一些综述总结了HPCE在生物样品（蛋白目前，对于蛋白质、多肽CZE分离的理论研究还质、肽、

4、氨基酸、核酸组分等）分析中的应用[3-6]。本文不成熟，大多为经验或半经验法。只讨论目前应用最为普遍的毛细管区带电泳(CZE)二、CZE分离蛋白质、多肽应解决的技术问题在蛋白质、多肽分析中的进展和仍然需要解决的一些问题。（一）吸附问题从理论上预测，CZE对蛋白质等大分子分离效一、CZE分离蛋白质、多肽的理论研究率很高（N먱106以上），但在实际分析中却难以实蛋白质、多肽是多价态、多官能团、带电荷的生现，这主要是由于蛋白质等大分子易吸附于毛细管物大分子，其形状、大小、电荷数是影响分离的主要内壁，不仅造成峰对称性差，大大降低了分离柱效，内在因素。分离体系中缓冲液种类及其浓度

5、、离子强而且由于吸附改变了毛细管内壁表面结构，使出峰度、pH值及各种添加剂都可能对蛋白质、多肽分子时间和出峰面积都不重现，难以准确地定性和定量。上各种官能团产生不同的影响，从而影响其分离过吸附是蛋白质、多肽分离中遇到的严重问题。程〔3〕。Lauer等[15]提出蛋白质与毛细管内壁间的非特McManigill等[7]对影响蛋白质分离的主要因素异性吸附主要来源于毛细管内壁硅羟基离解形成的进行了总结，Grossman等[8]仔细研究了CZE中缓冲带负电的吸附点与蛋白质、多肽分子中带正电的官液pH值及肽组成对分离效率和分离度的影响，并认能团之间的静电引力。为pH值是影响分离选择

6、性的主要因素。许多研究工作正致力于解决吸附问题，其解决Nyber9]证明对于小肽，其电泳相对迁移时间途径可分为如下三类：1.调节缓冲液pH值采用极端pH值的缓冲似的方法改善了组氨酸化合物等的分离。然而高离体系，或是在低pH值下(pH3)，抑制硅羟基离子强度缓冲液也带来一些限制：为了避免产生过量解[16]，或是使pH值高于所分离的蛋白质的等电的焦耳热，只能使用较低的分析电压，延长了分析时点[15,17]，都能减小吸附，如Lee等[17]采用高pH值的间，降低了分离柱效；或只能选用内径较细的毛细硼酸盐缓冲体系分离蛋白质，并指出在每次分析间管，提高了对检测器灵敏度的要求。隔中

7、用1mol/L的NaOH清洗毛细管可提高分离的Bushey等[35]提出使用两性离子添加剂不仅能重现性。由于蛋白质等大分子的多样性，仅调节pH减小蛋白质与毛细管壁及蛋白质分子之间的相互作值只能解决部分吸附问题，而且限制pH的使用范围用，而且不增加溶液的导电性，对电渗流影响小，为会限制分析方法的选择性，过高或过低的pH值还可优化蛋白质分离提供了较大的选择范围。他们用含能引起蛋白质的变性。2mol/L三甲基甘氨酸内盐及0.1mol/LK2SO4的缓2．毛细管内壁处理Jorgenson等[18]在早期的冲液取得了很好的效果。Waters公司研制