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《几种分子生物学方法在菌种鉴定中的应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第14卷第6期:35生物技术Vol14,No6:352004年12月BIOTECHNOLOGYDec2004Taq酶标记法:用随机引物和rSTK特定引物分别标记rSTK(图2)。反应体系:模板DNA25ng,2.5mmol/L的dCTP,32dGTP,dTTP和P-dATP各2L,10PCR缓冲液5L,25mmol/LMgCl24L,Taq酶1L(5个单位),50mol/L随机引物(图3A)或rSTK特定引物(r5,r3
2、)(图3B)1L,加ddH2O至50L。反应条件:953min,室温1min,722min,1-3个循环。探针纯化、杂交、洗膜、压片均按照文献[4]进行。2结果与讨论采用点杂交的方法检测了常规Klenow片段随机引物DNA探针标记法和Taq酶DNA探针标记法的标记效果。为了检测标记效果的差异,采用0.1、0.01、0.001ngDNA梯度浓度的杂交样点。从图3中可看出Taq酶标记法与Klenow片段标记法一样有较好的标记效果,尤其是用特定引物进行标记效果更好。随机引物标记效果稍差一些,可能是因为随机
3、引物太短,图3不同探针标记方法杂交结果A.Taq酶法(随机引物);B.Taq酶法(r5、r3特定引物);72延伸时易与模板分离。因此作者采用16mer寡核苷酸序C.Klenow片段随机引物标记列作为随机引物,而不是常规Klenow片段随机引物探针标记中的9mer寡核苷酸序列。从理论上讲,Taq酶反应一个循环可将DNA扩增一倍,也就是一个循环即可合成与模板等量的探针。但模板过多Taq酶反应效率可能略为下降,所以可以减少模板量和提高循环数来提高标记效率。Taq酶DNA探针标记法有以下优点。首先,Taq酶标
4、记法是一种廉价且快速的探针标记方法,步骤简便,30min内可以合成足够量的有效探针。普通Taq酶即可用来标记DNA探针。其次,Taq标记DNA探针效率也比较高,可以用于常规的Southern、Northern及点杂交。第三,随机引物和特定引物均可作为延伸引物探针标记,但特定引物标记效率更高。另外,Taq酶的热稳定性好,不易变性,易于保存。Taq酶也是实验图1rSTK片段的纯化电泳图室最常用的DNA扩增酶。因此分子生物学常规实验中可以1.EcoRI和PstI双酶切pMD-rSTK;2.切胶回收的rSTK片段T
5、aq酶代替Klenow片段进行DNA探针标记。参考文献:[1]AndrewP.Feinberg,BertVogelstein.AtechniqueforradiolabelingDNArestrictionendonucleasefragmentstohighspecificactivity[J].AnalyticalBiochemistry,1983,132(1):6-13[2]AndrewPFeinberg,BertVogelstein.AtechniqueforradiolabelingDNAre
6、strictionendonucleasefragmentstohighspecificactivity[J].AnalyticalBiochemistry,1984,137(1):266-267[3]CoxWG,SingerVL.FluorescentDNAhybridizationprobepreparationusingaminemodificationandreactivedyecoupling[J].Biotechniques,2004,36(1):114-122[4]JoeSambrook
7、,DavidRussellMolecularCloning:ALaboratryManual图2Taq酶DNA探针标记法步骤[M]3rdeditionColdSpringHarborLab(CSHL)Press,2001538-572.几种分子生物学方法在菌种鉴定中的应用1,211*周贤轩,杨波,陈新华(1.国家海洋局第三海洋研究所海洋生物遗传工程重点实验室,福建厦门361005;2.中国科学技术大学生命科学学院,安徽合肥230026)摘要:REP-PCR指纹法、PCR-RFLP分析法、16SrDN
8、A序列分析法在生物多样性研究、菌种鉴定、及微生物资源的开发应用中得到了广泛的应用,但最高分辨能力及适用性各不相同。该文采用上述方法对从厦门温泉分离到的嗜热菌进行了鉴定分析,并对GeneBank数据库中的同源性较近的细菌16SrDNA序列进行比较,结果发现:在这三种鉴定方法中,REP-PCR法最简单,分辨能力最强,可鉴别16SrDNA序列同源性大于99.5%甚至完全相同的不同菌株;16SrDNA分析能
