分子生物学方法在物种鉴定中的作用 --毕业论文

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1、【标题】分子生物学方法在物种鉴定中的作用【作者】刘莎莎【关键词】分子生物学、 rDNA-ITS、 PCR-RFLP、  物种鉴定【指导老师】梁姗【专业】生物科学【正文】引言物种是生物分类学的基本单位。物种指一个动物或植物群，其所有成员在形态上极为相似，以至可以认为他们是一些变异很小的相同的有机体，它们中的各个成员间可以正常交配并繁育出有生殖能力的后代，物种是生物分类的基本单元，也是生物繁殖的基本单元。遵循分类学原理和方法，对生物的各种类群进行命名和等级划分就是分类。为了更好的对物种进行分类，就要先对物种进行鉴定。过去关于物种鉴定和生物进化的

2、研究，主要依靠对不同种属间形态和解剖方面的比较来决定亲缘关系。二十世纪八十年代以来，随着聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术的出现，DNA分子生物学的发展迅猛，作为生物学领域的分类学采用DNA分子作为标记的文献也大量出现，遗传标记技术作为物种形态学分类鉴定的一种辅助手段被广泛的应用于属间、种间、品种间的分类鉴定和亲缘关系的研究中。随着蛋白质和核酸结构测定方法的进展，比较不同种属的蛋白质或核酸的化学结构，即可根据差异的程度来断定它们的亲缘关系。采用分子生物学技术鉴定物种是物种识别中最为热门也是发展最快的

3、，目前在很多方面都有使用。目前分子生物学方法在物种鉴定中主要采用的方法有：限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)、扩增性片段长度多态（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）、荧光免疫分析(FluorescenceImmunoassayAnalysis，FLA)、酶免疫分析(EnzymeImmunoassayAnalysis，EIA)等。

4、本文综述了当前在物种鉴定中的常用的分子生物学方法，并重点综述了核糖体DNA内转录间隔区序列分析以及聚合酶链式反应-限制性片段长度多态（PCR-RFLP）等方法，以及其在生物鉴定中的应用，为未来的物种鉴定中使用的分子生物学方法作一些探讨。1. 国内外研究进展传统的生物分类系统主要是根据生物的形态构造和生理生化特点为基础的自然分类系统，即根据生物所具有的特征，将生物逐级分类。以形态上的差异作为分类的依据，不同的分类学家有不同的标准，因此形态学观察有一定的主观性，对于形态上特别相似的物种往往是难以定论。随着科学技术的发展，一些新的技术手段应用到生

5、物的分类研究中。以甲藻为例，首先是化学分析技术，如毒素的高效液相色谱分析技术等等，对有毒赤潮动态变化及其可能导致的危害进行研究和监测；八十年代开始采用同工酶电泳分析方法，该方法是一种基于酶基因位点的分子标记技术，但一些性状是由多基因协调作用产生的，很不稳定，因此，也未能获得理想的结果；免疫技术，即克隆抗体技术，是通过把目标藻类注射到动物中，使得动物对那些未被破坏的外源生物产生抗体，采用抗体特异结合藻类细胞壁上的蛋白质，从而识别该目标藻种，但是容易发生交叉反应，即标识了非靶细胞，并且在不同学者的研究中得到了不一致的结果，该方法也未能在微藻分类

6、研究中得以广泛应用。RFLP是最早检测到DNA水平的分子标记技术。1974年，Grozdicker等在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，首次利用经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异进行检测，不久以后，人们开始用该方法构建遗传连锁图以及系统发育与品种鉴定等。1985年Cetus公司Mullis等发明的PCR的特定核酸序列扩增技术，更以其高灵敏度和特异性被广泛应用，为改进后的RFLP以及其后的RAPD、AFLP、PCR-RFLP等分子生物学技术的出现奠定基础[1]。PCR-RFLP是在PCR和DNA序列分析技术基础上产生的RFLP技

7、术，首先使用PCR技术获得目的基因片段，然后根据序列分析的结果，确定限制性内切酶酶切位点做RFLP分析，与经典的RFLP技术相比，试验步骤简单化，不需使用同位素，减少了实验室的污染[2]。DNA测序法通过测定目的基因片段的核苷酸序列，并比较序列间的差异来确定各类群间有鉴别意义的特异性位点，从而达到鉴定的目的。目前进行DNA测序的基因主要有用于植物类的叶绿体基因组r6cL、trnK、marK与rDNA18S、ITS、5SRNA基因，以及用于动物类鉴定的线粒体基因组cyt-b、12SrRNA基因等[3-5]。其中rDNA-ITS分析技术应用较为

8、广泛，技术也日益成熟。目前，国内外多通过ITS基因的差异分析作为鉴别种间关系的主要手段。2. 核糖体基因（rDNA）ITS序列在生物鉴定中的应用2.1 关于核糖体基因（rDNA）