几种菌种的保存及复苏方法.docx

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1、几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。　　操作步骤如下：1培养基制备1.1器皿准备　　培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。1.2溶解培养基配料　　先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅

2、拌均匀。1.3调pH值　　配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。1.4加凝固剂　　配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。1.5过滤分装　　在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养

3、基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。1.6包扎标记　　将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。1.7灭菌　　根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。1.8斜面摆放　　灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。1.9无菌检查　　将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。2接种2.1斜面接种2.1.1点接　　把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。2.1.2中央划线

4、　　从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。2.1.3稀波状蜿蜒划线法　　从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。2.1.4密波状蜿蜒划线法　　从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。2.1.5挖块接种法　　挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。2.2穿刺接种　　用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等

5、。2.3液体接种　　挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。3培养　　将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。4保藏　　培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1～3个月移植一次。　　保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。　　斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。液体石蜡保藏法　　亦称矿物油保藏法,定

6、期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。　　操作步骤如下：1液体石蜡的准备　　选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，采用以下两种方式进行灭菌：　　121℃湿热灭菌30min，置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。　　160℃干热灭菌2个小时，冷却后，经无菌检查后备用。2斜面培养物的制备　　参照定期移植法。3灌注石蜡　　将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入

7、培养好的新鲜斜面培养物上，液面高出斜面顶部1cm左右，使菌体与空气隔绝。4保藏4.1　注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4～6℃）干燥处保藏，保藏时间2～10年。4.2　保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。5恢复培养　　恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。3.标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.用于白色念珠菌复苏、复壮.液体硫乙醇

8、酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线