genome+shuffling在菌种改良中的应用

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1、万方数据A／。船鬻；哿圪j五么工姑?9燃GenomeshuⅢing在菌种改良中的应用来欣杰-，程瑶：(1．华北制药集团责任有限公司新药中心，河北石家庄050015：2．河北九派制药有限公司，河北石家庄050000)[摘要]GeD衄esbuffljng作为一种新型的选育方法，与传统方法比更加高效快捷，近年来不断被应用于制药、食品制造、环境工程等众多领域的菌种改良研究中。综述了Genomeshuffling在菌种改良中的应用．【关键词】Gen伽eshuffling；基因组重排；菌种改良[中图分类号]Q784[文献标识码]A[文章编号】1003—5095(2006)07—0011一03人类

2、在很早以前便开始利用杂交育种的方式对动植物进行品种的改良，这种有效的改进物种性状的方法在人类发展的进程中起到了非常重要的作用。随着对微生物世界的发现和探索，微生物发酵被广泛应用到食品、饮料、药品、饲料等制造行业中。因此选育具有优良性状的菌种成为了人们研究的重点，经过不懈努力不断有新的选育方法被发现，如传统的自然选育、诱变选育，以及更加先进的基因重组、基因工程、代谢工程等。本文所要讨论的Genomeshuffling(基因组重排)便是20世纪90年代出现并发展起来的一种快捷高效的菌种选育方法。任何物种的进化过程均是基因变异、表型筛选的持续过程。菌种的选育实际上是人为地加速了物种向某个特

3、定方向的进化过程。通过基因操作人们可以增加基因变异的多样性，人为创造出新型的突变体。1994年，Ste硼er[11首先提出了DNAshuffling这种在体外定向进化分子的方法。首先，将同源的DNA用DNAaseI进行消化成片段。然后，再将得到的随机片段无引物PcR，使之重新随机装配，从而获得了多种排列组合的突变基因库。最后，利用设计好的引物PcR，得到预期的重组体，见图1。“丑““攀。幽。图1DNA重排这种方法被不断应用于蛋白如酶、抗体等结构的改进方面。基于相似的原理，1998年，Ste岫er[2]等又[收稿日期】2006—04—24【作者简介】朱欣杰(1978一)，男，助工，主要

4、从事药品研发工作。提出了全基因组shuffling，通过定向进化技术使菌株的基因组得到随机的重排而达到选育目的。该法首先以传统的诱变方法获得一个突变体库，筛选出若干个正性突变株作为出发株，然后以多轮递推原生质体融合的方式使众多基因随机重组，最终从获得的突变体库中筛选出性状被提升的目的菌株。1Gen伽eshu什Ijng的特点。传统诱变通常是将每一轮产生的突变体库中筛选出的最优的一株作为下一轮诱变的出发株(图2a)，而Genomeshuffling则是将包含若干正性突变株的突变体库作为每一轮原生质融合的出发菌株，经过递推式的多轮融合，最终使引起正性突变的不同基因重组到同一个细胞株中(图2

5、b)。理论上这种方法能够比传统诱变选育更快速的改良菌株。*一．图2传统诱变方法与Gen伽eshuffling的比较另外，传统的诱变正性突变率很低，仅为10啕左右，改良一个菌种所需的筛选量很大，而且菌种在经过多次诱变后自身抗性增强，会导致诱变效率下降。Genomeshuffling只需在获得首轮shuffle的初始突变体库时进行诱变，因此可以基本避免诱变选育的上述缺点。为了证明该方法的有效性，Ying—Xinzhang等以泰乐菌素的生产菌streptomycesfradiae为研究对象，进行了一系列验证实验。首先，为证明多轮递推原生质体融合可以有效将多个亲本株的优良基因万方数据河北化工

6、第7期整合在同一个细胞株中，他们将S．fradiae的4个营养缺陷型菌株作为标记菌株，通过4轮无选择性条件的原生质体融合、再生，来验证基因整合的效果。4轮递推融合后同时出现4种标记菌株性状的细胞株高达2．5％，而一次融合后仅为0．000045％。另外，他们还以同一菌株出发，比较Genomeshuffling与传统诱变选育对菌种生产能力提升的效率。作为对照的菌株是一株经过20年、20轮理化诱变(sF1一sF21)的生产菌株。他们采用的方法是将SF1经化学诱变剂NTG诱变，得到了22000个突变株，再以筛选出的11株作为融合的的出发株，经过2轮原生质体融合最终筛选出2株产率高于sF21腑

7、菌侏Gs1、Gs2。图3传统诱变选育与shuffling选育效果比较由图3可以看出，利用Genomeshuffling经过1年、24000株筛选，获得了传统诱变方法20年、106株筛选的效果圆。2Genomeshuffling的应用Genomeshuffling的有效性被证明后，受到了学术界极大的关注，并且不断被应用在工业微生物、以及用于环境治理的菌种改良研究中。2002年，RanjanPatnaik等将该方法应用于乳酸生产菌Lactobac订lus的低p