《牛海绵状脑病》PPT课件

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24牛海绵状脑病(BovineSpongifornEncephalopathy,BSE) 1、前言牛海绵状脑病(BovineSpongifornEncephalopathy,BSE)俗称疯牛病,它是一种类似脑病毒感染的传染病,以潜伏期长,病情逐渐加重,终归死亡为特征,本病死亡率很高。首先发现的人类朊病毒疾病是库鲁病,在动物中最早发现的是羊瘙痒病。1985年4月发现,1986年11月将该病定名为BSE。 动物及人的各种朊病毒病:牛疯牛病羊羊瘙痒症貂貂传染性脑病猫猫海绵状脑病偶蹄动物偶蹄动物脑病人克雅病人新变异型克雅病人致死性家族遗传性失眠症人格施谢三症 由于此病迄今尚无法治疗,又有传染给人之可能性,使人得一种病死率极高的中枢神经退化病———新型克雅病(NewVarientCreutzfeldt-Jakobdisease,NV-CJD),因此,疯牛病不仅对经济造成严重损失,而且引起了全球对疯牛病的恐慌。 2、病原学朊病毒(Prion,有人译为朊粒或朊蛋白)是一种特殊传染因子,它不同于一般病毒,也不同于类病毒,它没有核酸,而是一种特殊的糖蛋白。用PrP代表(Pr代表Prion,P代表Protein)。 PrPPrPc:是正常细胞具有的，对蛋白酶敏感，易被其消化降解，存在于细胞表面，无感染性。PrPsc:当结构异常时，就成为另一类有致病性PrP，对蛋白酶K有一定抵抗力。 prpc与prpsc的对比:prpcprpsc氨基酸结构相同,a-螺旋较多相同,β-片层较多核酸无无蛋白酶无抵抗力有抵抗力致病性无有抵抗力 生物学特性:朊病毒是一种有两种结构型,一种是prpc,正常情况下存在于细胞表面,无感染性,可被蛋白酶K消化降解,可溶于去垢剂。当蛋白结构由α螺旋变构成β片层结构时,具有了致病性,称prpsc,而不被蛋白酶分解,不溶于去垢剂。 为什么会出现这种现象呢?经过深入研究,发现一种称为x蛋白的物质参与了这种转变,当prpc与prpsc的第96～167位氨基酸结合,同时prpscC端残基再与x蛋白结合,这时促使prpc变构成prpsc。 3、流行病学传染源含有被朊病毒污染的肉骨粉传播途径主要经过消化道而传染易感动物易感动物有牛、羊、猪、羚羊等流行特点无明显季节性,潜伏期长 BSE患牛的比例:高比例低比例奶牛群哺乳牛群牛群大牛群小小牛牛大 最近,美国和冰岛的科学家对BSE蔓延又有新解释,他们认为,BSE的传播与生活在农场干草中的螨虫有关。 4、临床症状BSE和痒病在临诊上有许多相似的地方,最大的区别是BSE很少出现搔痒症状。神经症状可分为三个类型。一型通常出现恐惧、暴怒和神经质二型3%的病例姿势和运动异常,后肢共济失调、颤抖和倒下三型90%的病例有感觉异常,触觉和听觉减退 惊恐不安，有攻击性恐惧不安，狂奔 5、病理变化牛海绵状脑病无肉眼可见的病理变化,也无生物学和血液学异常变化。典型的组织病理学和分子学变化都集中在中枢神经系统。牛海绵状脑病有三个典型的非炎性病理变化: 病理变化(1)星型细胞肥大常伴随于空泡的形成(2)牛海绵状脑病存在淀粉样病变,但不多见(3)出现双边对称的神经空泡 神经纤维网空泡核浓缩 运动神经障碍脑组织 分子病理学变化:除了痒病家族应有特征性组织病理变化外,牛脑组织提取液中还含有大量的异常纤维(SAF),可用电镜负染技术观察到,这对牛感染牛海绵状脑病的确诊非常重要。 6、诊断机体感染BSE后既无任何炎症,也不产生免疫应答,所以该病至今尚无血清学诊断方法,病牛的血液生化指标也无显著异常。因此本病的诊断主要依据流行病学、临床症状和组织病理学进行初诊,通过死后脑组织采样,检测SAF以确诊BSE。 6.1病理学方法病理组织解剖及动物传递传染实验多用于发病后期及死后诊断，用任何新方法做出的阳性结果均需用此方法作以最终判定。 6.1.1组织病理学方法是对BSE感染的脑超薄切片进行电子显微镜观察，从而确诊BSE疾病的一种方法。但这种检查一般是在疾病发展的后期进行，难以实现BSE的活体检测。 6.1.2动物试验动物试验检测方法主要通过用怀疑感染患者的主要病变组织提取物注射到易感动物体内，通过观察易感动物的症状来诊断PrPsc。同种动物间的传播效率最高，而不同种动物间的传播具有种属屏障。 6.2免疫学检测6.2.1WesternblotWesternblot是现在常用的蛋白质检测方法。主要原理是PrPsc在蛋白酶K作用下产生PrP27230,而PrPc会被完全消化,用antiPrP27230抗血清与PrP27230进行免疫反应即可检测出。由于样品需要蛋白酶K预处理,则不可避免地造成PrPsc和少量PrPc降解,影响了该法的敏感性。 6.2.2ELISA此法是在westernblot基础上建立的。进行检测时,由于经蛋白酶K处理后,PrPsc转变生成PrP27230,后者吸附于塑料表面,免疫反应性降低,用硫氰酸胍变性后,可使其表位充分暴露,免疫反应性增强。 6.2.3免疫组化免疫组化是利用标记的特异性抗体来显示组织切片上的PrPsc。该法的主要原理是用单克隆抗体15B3能区别PrPc和PrPsc,并把PrPsc沉淀而不沉淀PrPc,可用于检测PrPsc。该法不但可以定性、定位研究PrPsc，还可以做到定量。 6.2.4免疫印迹检测以抗体T1对经蛋白酶K消化的脑组织提取物进行免疫反应，根据消化后的样品中是否含有抗蛋白酶K的PrPsc存在及其分子量的大小，就可以检测机体是否被BSE所感染。 6.2.5蛋白错误折叠循环扩增该法由Saborio等创立,其主要是用类似于PCR的原理体外扩增PrPsc的方法,称之为蛋白错误折叠循环扩增(PMCA)。该法基于体外少量PrPsc能使大量PrPc构象发生转换,生成PrPsc,形成PrPsc凝集物,用超声处理后生成许多小的PrPsc单位,再以这些小的单 位为“模板”,以PrPc为“原料”继续合成PrPsc,多次循环之后，扩增产物中97%以上的蛋白具有蛋白酶抗性,蛋白酶消化后,westernblot检测PrPc。该方法灵敏度高,为PrPsc的检测开辟了新的领域。 6.3仪器检测法6.3.1毛细管电泳Schimerr等(1999)首次报道了毛细管电泳可以检测TSE患者血液中PrPsc。其原理是将抗原抗体竞争试验与毛细管电泳结合起来。 6.3.2光谱分析目前光谱分析可分多光谱紫外荧光分析(MUFS)和共聚焦双色荧光相关波谱分析(FCS)两种。光谱分析方法可直接检测PrPsc,不需要蛋白酶K预处理。多光谱紫外荧光分析不需要借助于PK处理及特异性抗体就能直接检测。 共聚焦双色荧光相关波谱分析可检测溶液中荧光标记的单分子,待检分子发射的荧光光子被激光识别后,聚在一个点上,在单光子检测上成像。 6.3.3高效液相色谱利用高效液相色谱检测与PrPsc相关的疾病。该法主要是利用高效液相色谱检测prion蛋白基因(PRNP)上某些与PrPsc相关的位点(如129位点),从而达到检测PrPsc的目的。 7、各国检测BSE的新方法7.1奥地利奥地利克普勒大学的科学家研制出用高灵敏度荧光显微镜和特殊抗体快速测定活牛BSE的方法。朊病毒绝大部分集中在牛脑和脊髓里,在牛血中其含量极其稀少。 克普勒大学研制出一种带有发光的染料分子抗体,这种抗体加入血样后,会附着在PrP上。借助于高灵敏度的荧光显微镜,就可以发现着色的PrP。 7.2法国法国用单克隆抗体检测人、牛、绵羊、鼠的PrP。与传统检验BSE的方法相比,这种新的检测方法无需对牛进行宰杀,在感染早期只需取出其部分大脑样本即可,也可用于死后检测。 7.3德国德国新发明了一种活体快速检测方法。这种检测法可以通过对活牛抽血化验,迅速确诊牛是否已经被感染。这个方法与检查糖尿病用的血糖测试法相似。 先将BSE抗体用发光剂标记，然后将其与被检牛的血样混合接着用一种“洗涤剂”清洗掉其中的干扰成分。经过发光剂处理的抗体会在血样中寻找朊病毒，一旦发现就会立即标识。 7.4瑞士有研究表明海绵状脑病的神经损伤可能是PrP与细胞内其他物质发生作用所致，血纤维蛋白溶酶原就是这类物质中的一种。瑞士苏黎世大学医院从人体和实验鼠的血清中分别提取血纤维蛋白溶酶原，将其涂在带磁性的微珠上，然后将感染羊痒病的实验鼠脑组织提取物与磁珠混合，发现血纤维蛋白溶酶原可与PrP结合。 7.5英国鉴于朊病毒侵入大脑前首先在脾脏复制,通过分析正常小鼠脾脏和感染BSE小鼠脾脏的大约10000份RNA转录物,发现在感染小鼠的脾脏中，红细胞分化相关因子(EDRF)的转录水平下降。不仅如此,患BSE牛的骨髓中，EDRF水平同样低于正常。但还不清楚朊病毒感染后EDRF减少的机理。据此原理，通过检测血液中EDRF水平来诊断BSE，在小鼠和羊试验成功。 7.6美国和以色列美国对vCJD、BSE和其他传染性海绵状脑病的尿液检验方法,这种方法可准确诊断BSE。一种独特的、高度敏感的检测技术———构象依赖的免疫测定(CDI),CDI能有效地发现正常个体和捐献的血浆中少量的朊病毒。 7.7我国BSE检测现状我国在吸取了国外先进技术的同时，检测疯牛病的方法也正日臻完善。目前，我国共有3个国家级的BSE检测实验室，即农业部动物检疫所(青岛)、北京出入境检验检疫局和中国农业大学的BSE检测实验室。北京出入境检验检疫局技术中心BSE检测实验室主要采用病理学方法、免疫组化法和免疫转印法。 动物检疫所全国疯牛病检测中心从瑞士引进了免疫转印、免疫组化和酶联免疫吸附测定等PrP免疫检测技术,目前主要采用免疫组化法,因为它的检测成本比较低廉,特别是试剂。 8、防制由于目前该病没有有效治疗方法，主要以预防为主，为了控制本病，各国纷纷采取措施，禁止从发生BSE的国家进口牛、牛制品及反刍动物性饲料，切断BSE的传播途径。我国为防止疯牛病传入,也采取了一系列行之有效的措施,早在1990年6月农业部就印发了《关于严防牛海绵状脑病传入我国的通知》，决定停止从英国进口牛、牛精 液、牛胚胎、牛肉、牛骨粉等，并禁止从有牛海绵状脑病的国家进口牛及其产品。1992年6月，该病增列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》中的一类传染病，作为我国进境动物检疫的重点防范对象。2001年2月14日，农业部发布了《中国疯牛病风险分析与评估》报告，报告认为由于管理严格，我国尚无发生传播疯牛病的基本要素，报告结论是我国目前没有疯牛病。 尽管如此，当今防止国外疯牛病传入我国，仍然是一个不容忽视的重大问题，这不仅事关全国人民生命和畜牧业健康发展，而且关系到社会和政治稳定大局，因此各口岸动物检疫机构要确实加强对进境动物产品的检疫和监管工作。