实时荧光定量PCR技并及在畜牧兽医中的应用

《实时荧光定量PCR技并及在畜牧兽医中的应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、lo．軎医研究1．3荧光探针和荧光染料实时荧光定量：R技术RT—FQ—PCR依靠荧光探针或荧光染料来相对间接确定样本起始拷贝及在畜牧兽医中的应用数。1．3．1SYBRGreenIDNA结合染料：徐波t张建超z’SYBRGreenI是一种双链DNA结合染(1湖南农业大学外国语学院，湖南长沙410128；2湖南省浏阳畜牧水产局)料，与双链DNA结合后．其荧光增强约l000倍。在PCR反应体系中．加入过中图分类号：S811．3文献标识码：A文章编号：1008—0414(2009)12--0010-03量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特摘要RT—FQ—PCR技术是一种

2、最新pcR技术，具有特异性强、灵敏度高、异性地掺人DNA双链后，发射强荧光重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，在畜牧兽医中已得到了广泛的应信号，而不掺入链中的SYBR染料分子用，虽然该技术目前仍存有许多有待解决的问题，但因其所具有的独特优势，必定仅有微弱荧光信号背景。荧光信号的会在生命科学领域得到更广泛的应用。该文就RT—FO—PCR概念、原理、方法、应用、增加与PCR产物的增加同步。存在问题及应用前景等作了综述。SYBRGreenI通用性好。与所有的双链关键词实时荧光定量PCR应用畜牧兽医DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，价格相对较低。多聚酶链

3、反应polymer．sechain一般将PCR反应前l5个循环的荧光信1．3．2Taqman探针：TaqMan探针是一reaction，PCR)技术自20世纪80年代以号作为荧光本底信号，荧光域值是种寡核苷酸探针．荧光基团连接在探来，以其简便、快速、灵敏的特点一度PCR3-15个循环荧光信号标准差的针的5末端，而淬灭基团在3末端。当成为实验诊断学的热点；但其易污染、l0倍，荧光域值设定在PCR扩增的指探针与靶序列配对时．荧光基团发射假阳性及不能定量等问题也日益突数期。的荧光团与3末端的淬灭基团接近而出。易导致不良后果，使其临床应用受1．1．3CT值：表示每个PCR

4、反应管内被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的到限制。近年来出现的实时荧光定量荧光信号到达设定的域值时所经历的5外切酶活性将探针切断．使得荧光PCRfreal—timefluorescenceQuantity循环数。研究表明，各模板的CT值与基团与淬灭基团分离．发射荧光。随着PCR，RT—VQ—PCR1技术集PCR和DNA该模板的起始拷贝数的对数存在线性扩增循环数的增加．释放出来的荧光探针杂交技术的优点为一体．直接探关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反基团不断积累．Taqman探针检测的是测PCR过程中的荧光变化，获得DNA之亦然。利用已知起始拷贝数的标准积累荧光。模

5、板的准确定量结果．实现了PCR从品可作出标准曲线，其中横坐标代表1．3．3分子信标：分子信标(molecular定性到定量的飞跃．以其特异性强、起始拷贝数的对数．纵坐标代表CTbeacon)是一种呈发夹结构的茎环双标灵敏度高、重复性好、定量准确、速度值。因此，只要获得未知样品的CT值，记寡核苷酸探针。两端的核酸序列互补快、全封闭反应等优点，成为分子生物即可从标准曲线上计算出该样品的起配对。因此标记在一端的荧光基团与标学研究中的重要工具。始拷贝数。记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光1．2实时荧光定量PCR的特点基团被激发后产生的光子被淬灭基团淬1实时荧光定量PCR技

6、术的概1．2。1特异：荧光定量PCR具有引物灭：由荧光基团产生的能量以红外而不述和探针的双重特异性，故与传统的是可见光形式释放出来。RT—FQ—PCR技术是指在PCR反PCR相比，特异性大为提高。在模板不存在时形成茎环结构，应体系中加入荧光基团．利用荧光信1_2．2敏感：荧光定量PCR的敏感度当加热变性会互补配对的茎环双链解号累积实时监测整个PCR进程，最后通常达llY个拷贝／mL，对期数分析。线开．如果有模板存在环序列将与模板通过标准曲线对未知模板进行定量分性范围很宽，为0～1O“个拷贝／mL。一般配对，分子信标将成链状而非发夹状，析的方法。来讲临床标本中病原体

7、的数目为0～使得荧光基团与淬灭基团分开。当荧1．1定量原理10，卟拷贝／mL，在此范围内荧光定量光基团被激发时．发出激发光子。由于荧光定量PCR技术涉及到3个基PCR定量较为准确，标本不需要稀释。是酶切作用的存在，分子信标也是积本概念1-2．3重复：荧光定量PCR结果相当累荧光。1．1．1基线(baseline)：是指在PCR扩稳定，因为域值在指数扩增期。在此阶1。3．4LUXPrimers：L1J)(flightupon增反应的最初数个循环里，荧光信号段，各反应组分浓度相对稳定，没有副extenfion)引物是利用荧光标记的引物变化不大。接近一条直线．这样的直线

8、作用。CT