贴壁和悬浮培养的神经前体细胞生物学特性研究及酒精对神经前体细胞Cz43表达的影响

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1、山东大学硕士学位论文贴壁和悬浮培养的神经前体细胞生物学特性研究及酒精对神经前体细胞Cx43表达的影响硕士研究生：孙涛专业：细胞生物学导师：辛华教授中文摘要研究背景：神经前体细胞(neuralprecursorcells，NPCs)是中枢神经系统中处于不同发育阶段的不成熟神经细胞的总称，具有自我更新、增殖和分化为各类神经细胞的潜能，是公认的神经损伤修复的种子细胞。应用体外扩增的NPCs对神经系统创伤、变性及退行性疾病的治疗具有广阔的应用前景。1992年，Reynolds首先建立了NPCs的体外悬浮培养方法，开创了NPCs体外培养、扩增及其应用的新纪元。1995年Ga

2、ge建立了NPCs的贴壁培养方法，大大推动了对NPCs的相关研究。但目前国际上对NPCs的研究仍然处于初级阶段，对两种不同培养方法获得的NPCs生物学特性研究资料还非常缺乏。我国开展NPCs的研究起步较晚，目前主要使用悬浮培养的方法开展工作。为了深入开展对NPCs相关研究，本课题在完善NPCs贴壁培养方法的基础上，对比研究了两种培养条件下的NPCs的生物学特性，为深入开展NPCs的基础研究和临床应用研究提供实验依据。胎儿酒精综合征(fetalflcoholsyndrome，FAS)是母亲在妊娠期间过量饮酒造成的子代出生缺陷，其症状包括一系列的中枢神经系统发育异常。

3、体内、外实验发现，酒精可抑制NPCs的增殖，并导致部分NPCs死亡，这被认为是FAS发病的原因之一。但对于酒精损伤NPCs的机理，目前了解还比较少。文献报道，连接蛋白43(connexin43，Cx43)在NPCs增殖过程中具有重要的作用。酒精对NPCs增殖的抑制作用是否与Cx43的表达有关，目前尚未见相关报道。研究目的：1、对比研究贴壁培养法和悬浮培养法在体外培养获得的NPCs的生物学特性，为深入开展NPCs的基础研究和临床应用研究提供实验依据。山东大学硕士学位论文2、建立体外贴壁培养NPCs的酒精损伤模型，研究酒精对体外培养的NPCs中Cx43表达的影响，探讨

4、酒精抑制NPCs增殖的作用机理。研究方法：以孕14d的胎鼠端脑为实验材料，分别采用贴壁培养和悬浮培养方法进行NPCs的原代、传代及冻存复苏后培养，进行下列实验：1、两种培养方法获得的NPCs的生物学特性对比实验(1)倒置相差显微镜下，每天对培养细胞进行形态学观察，并拍照；(2)用免疫荧光细胞化学方法及流式细胞术鉴定培养细胞中NPCs的纯度；(3)用BrdU掺入方法分析NPCs的增殖能力；(4)用细胞计数方法分析两种原代培养方法获得的NPCs的生长曲线；(5)采用去除生长因子的方法诱导NPCs分化，用免疫荧光方法鉴定各类分化细胞并分析其比例特征。2、酒精对NPCs的

5、Cx43的表达的影响(1)建立贴壁培养NPCs酒精损伤实验模型，采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化，并拍照；(2)采用MTT法检测NPCs琥珀酸脱氢酶的变化，分析酒精对NPCs活性的影响；(3)采用免疫荧光方法观察体外贴壁培养的NPCs中Cx43的表达情况；(4)采用Western-blot法检测NPCs中Cx43的表达量，分析酒精对NPCs中Cx43表达的影响；(5)通过刻痕标记／荧光扩散实验，观察荧光黄(LuciferYellow，LY)在NPCs之间的扩散距离，分析酒精对NPCs间隙连接功能的影响。实验结果：1、两种培养方法获得的NPCs的生物学特性对比实验

6、(1)形态学观察贴壁培养的NPCs表现出典型的神经上皮细胞的形态特征，细胞群体呈集落状生长，随着培养时间延长，细胞呈放射状向外延伸；悬浮培养的NPCs呈球状克隆生长，细胞多数呈圆形，细胞连接紧密。传代以及冻存复苏后培养的NPCs形态均无明显变化：(2)NPCs纯度鉴定原代贴壁培养细胞中nestin阳性细胞率由第3天的38．69％增加至第9天的93．76％，而原代悬浮培养细胞第9天的nestin阳2山东大学硕士学位论文性细胞率仅为59．75％；两者传代后第2天，贴壁培养细胞的nestin阳性细胞率可达98．36％，悬浮培养细胞为83．34％；冻存复苏后培养第4天，两

7、种方法获得的NPCs纯度达均可达到99．9％；(3)NPCs的增殖能力检测原代贴壁培养的NPCs的增殖指数，由培养第3天的13．68％增加至最高的第7天的38．7％；悬浮培养第7天的NPCs的增殖指数亦达最高，但仅为33．47％；贴壁培养细胞在传代后第2天和复苏后培养第4天，增殖指数分别可达39．08％和39．25％，而悬浮培养的NPCs这两种条件下的增殖指数仅为36．95％和36．73％；(4)原代培养NPCs生长曲线分析两种培养方法获得的生长曲线均为“S"形曲线，但在细胞数量上有明显差异。贴壁培养第12天时，细胞数量最多，为初始接种数的68倍，继续培养细胞数量

8、开始降低；