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《人骨髓内皮前体细胞的体外培养和生物学特性论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、人骨髓内皮前体细胞的体外培养和生物学特性论文郑奇军，王锐安，蔡振杰，俞世强，欧阳辉，赵建斌【关键词】种子细胞【Abstract】AIM:Topurifyandculturehumanbonemarrobonemarroedium(EGM2).EPCsicroscope,thecellgroicroscopeexaminationandimmunofluorescencestainingfortheexpressionofⅧ/v2MV).ThesefindingssuggestthatEPCsmaybeanearro/cytology
2、;stemcells;tissueengineering;seedcells【摘要】目的：体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞，研究其基本生物学特性.方法：利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞，再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞.freela），淋巴细胞分离液与PBS液（TBD公司），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡盐液（Gibco），VEGFR2兔抗（NeoMarkers,USA），第Ⅷ因子鼠抗(北京中山公司），二抗（FITC羊抗鼠与Cy3羊抗兔，Sigma），FITCconjugatedCD34鼠抗（RD公司
3、）.1.2方法1.2.1骨髓中单个核细胞的分离［2］无菌条件下，取人骨髓液5mL，加入肝素，用PBS液充分混匀，转入离心管，轻轻地层加到1077g/L的淋巴细胞分离液上，2000r/min离心20min，收集中间的单个核细胞层，用PBS液1000r/min离心洗涤2次×10min以洗除残余淋巴细胞分离液，然后收集细胞备用.1.2.2EPCs的培养收集骨髓中单个核细胞，用含胎牛血清和多种生长因子的内皮细胞生长培养基混匀，制成细胞悬液，接种于以黏连蛋白（Fn）包被的培养瓶中，置37℃含50mL/LCO2孵箱中培养，第4日换液，去除非贴壁
4、细胞，此后每3~4d换液1次.相差显微镜下观察细胞形态，待细胞长满瓶底的80%，用0.125g/L胰酶消化，并以2×107/L细胞数传入24孔培养板中，每日取4孔细胞进行计数并求均数，绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间.1.2.3流式细胞仪检测取对数生长期骨髓EPCs,以0.125g/L胰酶消化后制备单细胞悬液，测定细胞生长周期；同时，检测细胞表面抗原CD34表达，鉴定所得细胞纯度.1.2.4EPCs细胞表面抗原免疫荧光染色检测培养10d的细胞进行免疫荧光化学染色，检测细胞表面抗原VEGFR2与Ⅷ/v期细胞为14.7%，S期细胞
5、为14.2%，说明EPCs细胞增殖比较活跃.2.3骨髓EPCs表面标记的检测EPCs细胞均表达Ⅷ/vACS)进行分离得到，此法所得细胞均一性好，纯度高，但价格昂贵，实用价值欠佳，同时，EPCs吞噬的磁性微粒也必然影响细胞的代谢及功能［4］.本实验中，根据细胞密度的差异，针对EPCs属于单核类细胞的特点，抽取骨髓后，用密度梯度离心法分离出单个核细胞层，再利用内皮细胞生长条件培养基外加黏连蛋白黏附特性，最终所得贴壁细胞即为EPCs.同时，我们对所得到的骨髓EPCs用流式细胞仪检测表面抗原表达，结果显示细胞均一性较好，CD34阳性表达率7
6、2%，也进一步鉴定了所得到的细胞为较高纯度的骨髓内皮前体细胞.此方法简单、经济、高效，具用较高的应用价值.VEGFR2是内皮细胞生长的早期表面受体，主要出现在内皮细胞诱导转化的早期［5］.Ⅷ因子是内皮细胞特异性抗原，可以通过vilMedUniv,2002;23(20):1871-1873.［3］AsaharaT,MuroharaT,SullivanA.Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis［J］.Science,1997;275(14):964-967
7、.［4］EggermannJ,KlicheS,JarmyG,etal.Endothelialprogenitorcellcultureanddifferentiationinvitro:Amethodologicalparisonusinghumanumbilicalcordblood［J］.CardiovasRes,2003;58:478-486.［5］MarioP,AfzalJN,DanielP,etal.ExpressionofVEGFR2andAC133bycirculatinghumanCD34+cellsidentifi
8、esapopulationoffunctionalendothelialprecursors［J］.Blood,2000;95:952-957.［6］HristovM,Erlobilization,differentiation,an
