RP-HPLC测定麻黄碱手性对应异构体

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1、http://www.paper.edu.cnRP-HPLC测定麻黄碱手性对应异构体1*221,2石贵阳,董世建,卢燕,张梁1．江南大学工业微生物技术教育部重点实验室，江苏无锡(214122)2．江南大学生物工程学院，江苏无锡(214122)E-mail：gyshi@jiangan.edu.cn摘要：用RP-HPLC分离测定了生物转化液中的l-麻黄碱、d-伪麻黄碱及前体物质1-苯基-2-甲胺基丙酮（1-phenyl-2-methylamine-acetone，MAK），采用ZORBAXSB-C1

2、8柱，UV检测器，以0.02mol/L的V(KH2PO4):V(甲醇)：V(醋酸)：V(三乙胺)＝96：4：0.1：0.13作为流动相，体积流量1mL/min，柱温35℃，检测波长210nm，MAK、l-麻黄碱、d-伪麻黄碱的检出限分别为0.05，0.2，0.1mg/L，分别测定了两株菌生物转化液中的MAK、l-麻黄碱、d-伪麻黄碱的质量浓度，回收率为97.2%～99.3%。关键词：高效液相色谱法；MAK；l-麻黄碱；d-伪麻黄碱；生物转化中图分类号：O657.72文献标识码：A1引言麻黄碱是重

3、要麻黄的主要活性成分，其化学名称是1-苯基-2-甲氨基丙醇，分子式为C10H15NO。因为分子中有两个手性碳，故有四种旋光构型体，其中构型为1R2S的麻黄碱也称赤藓糖型麻黄碱，又叫l-麻黄碱，或直接称麻黄碱；其立体异构体1S2S构型属于苏糖型，称d-ψ-麻黄碱、d-伪麻黄碱，或直接称为伪麻黄碱，结构式如图1。这两种麻黄碱均具有松[1]弛平滑肌、收缩血管、抗炎、抗菌、抗病毒、镇咳平喘等功效。临床主要用于支气管哮喘、过敏性反应、鼻粘膜肿胀以及低血压等病的治疗。[2]传统的麻黄碱生产不仅不能满足市场需

4、求，而且还带来严重的生态破坏问题。利用微生物体内一些具有高度立体选择性的酶或酶系作催化剂，制备手性药物具有许多有点，特别是转化率高和产物单一，作者利用前体物质1-苯基-2-甲胺基丙酮（MAK），经生物转化可直接生成麻黄碱或伪麻黄碱。OHOHCH3CH3NHCH3NHCH3图1l-麻黄碱和d-伪麻黄碱结构图Fig.1Structuralformulaofl-ephedrineandd-pseudoephedrine[3][4]已报道的麻黄碱的测定方法很多，如毛细管电泳法及气相－质谱法。但还是以高效

5、[5]液相法最多，如离子对高效液相色谱法等；有人以(-)-氯甲酸薄荷醇酯作为手性衍生化试[6]剂，l-麻黄碱与d-伪麻黄碱衍生化后生成一对非对映异构体，再用反相高效液相色谱检测，虽然能够分离两种麻黄碱，但是需要手性衍生化处理样品。此外还有人用薄层层析法分离了[7]MAK和麻黄碱，但是无法确定分离和测定l-麻黄碱与d-伪麻黄碱这一对异构体。作者采用常用C18色谱柱，以甲醇和磷酸盐缓冲液作流动相，首次同时测定了生物转化液中MAK、l-麻黄碱和d-伪麻黄碱。样品不需要复杂的前处理，方法快速、准确、简便

6、。-1-http://www.paper.edu.cn2材料与方法2.1试验材料2.1.1菌种Morganellamorganii江南大学生物资源研究室保藏.2.1.2发酵培养基(质量分数)葡萄糖3.0%,酵母膏0.5%,蛋白胨2.5%,K2HPO40.3%,MgSO4·7H2O0.02%,NaCl0.2%,酵母营养盐20mg/L,去离子水配制,用NaOH调pH＝7.0，0.1MPa灭菌15min。2.1.3转化前体1-苯基-2-甲胺基丙酮（1-phenyl-2-methylamine-acet

7、one,MAK）：江南大学生物资源研究室合成。2.1.4高效液相色谱系统Agilent1100series高效液相色谱仪，G1314紫外检测器，ZORBAXSBC18柱。2.2实验方法2.2.1转化液的制备从保藏斜面接种到发酵培养基，30°C，150r/min活化24h，按10%的接种量转接，相同条件下培养48h后，3000r/min离心40min得菌体，用缓冲液洗涤两次，离心。去0.4g湿菌泥，加入葡萄糖和转化前体物质MAK，用磷酸缓冲液配成1mL反应溶液，葡萄糖和MAK终质量浓度分别为1g/

8、100mL和5g/100mL。反应液在30°C，150r/min条件下反应48小时后1000r/min离心10min，取上清液。2.2.2样品的处理生物转化液在8000r/min下离心15min，分析前用0.22µm的水膜过滤处理。2.2.3磷酸缓冲液的配制分别配制0.2mol/L的KH2PO4和Na2HPO4的A、B液，按各pH的要求，按比例配置成0.2mol/L的磷酸缓冲液。2.2.4色谱条件0.02mol/L的V(KH2PO4):V(甲醇):V(醋酸):V(三乙胺)＝96:4:0.1:0.