Zn金属硫蛋白间接竞争型ELISA的建立与应用

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1、要ELIsA以其快速、准确、安全、简便的特点而成为定量测定生物体内微量有机物的理想方泫。木实验的爵的就是为了建立一套快速、有效、方便并熊定量测定猪体组织中MT含量的ELIsA法，为动物科学中的研究和应用提供MT的定量测定技术。1．猪MT抗小鼠抗血清的制备：用戊二醛法将纯品zn—MT与载体蛋白(BsA)偶联后，作为人工抗原，对昆明小鼠皮下注射。首次免疫时抗原中MT量分别为8ug／只、16ug／只、32ug／只、64ug／只、128ug／只；加强免疫时所用抗原量依次加倍。前3次免疫时采用的是弗氏完全佐剂乳化，后3次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化。两批小鼠拥强免疫的肘间隔分别为lO日和14

2、且。用免疫双扩教方法测定抗血清效价。得出以下结论：当首次免疫抗原中MT的量为16—32ug／只，每次加强免疫时抗原量加倍，加强免疫间隔时间为10日时，其免疫效果较佳，可使大部分小鼠抗血清效价达到l：16以上。2．抗体的纯化及鉴定；将效价达到l：16以上的MT小鼠抗血清用饱和硫酸铵盐析法浓缩出Y一球蛋白，然后用DEAE—sephadexA50层析柱分离提纯IgG。实验中发现洗脱液pH值为7．4时洗脱第一峰即为纯化的IgG，用不连续缓冲系统聚丙烯酰胺凝胶浓度梯度龟泳鉴定层析洗脱下的!gG达到屯泳纯。对纯化后的IgG进行辣根过氧化物酶标记，用直接ELISA鉴定其为MT的特异性抗体。3．

3、ELISA的建立：运用固相抗原间接非竞争型ELISA和固相抗原间接竞争型ELIsA检测猪体组织中部分样品MT的含量，结果表明；用间接非竞争型ELIs^测定样品时其结果不够稳定。同一样品所对应的oD值相差较大，此方法仅适合于样品中MT定性检测；采用间接竞争型ELIsA测定样品，0D值比较稳定。用方阵滴定法确定了间接竞争型ELISA的各项具体条件：抗原最佳包被浓度为6．25ug／ml，一抗(鼠抗猪)使用适宜浓度为50ug／mI，酶标抗体(山羊抗小鼠)的使用浓度为i／8000倍，反应时间为3hr。用标准MT，采用间接竞争型ELIsA方法拟合的标准曲线回归方程为：y=105×2“。””“

4、”“’，相关系数为：R-o．9592。本方法的灵敏度为4．1ng／ml，批间和批内变异系数为9．9760％．14．385896，在实际应用中有较好的稳定性。说明本试验建立的间接竞争型ELIs^具有特异性强、灵敏度较高、稳定性和重复性好、适合于大批量样品的检测等优点，不失为对MT进行定量分析的一种有效方法。关键词：金属硫蛋自抗体：金属硫蛋自：闼接竞争型￡LIsA；阐接菲竞争型ELIsA；免疫AbstractELISAisbecominganoptimalmeFhodthatcoulddeterminethequantumoforganiccompoundinorganismbeca

5、useofitsspeediness，specificityandsensitivity．Thepurposeofourresearchwastoestablishasetofc。f『Ipleteassaydeteminedquantu讯。fmetallothioneinins再in8’sbody．1．thepolyclonalanLiseruminmiceofMTwhichwasdist“ledfromswinewasprepared：AftertherarefiedMT—11wascoupledtocarrierproteinBSAbymeansofGD，theprotein

6、—haptencunjugateswasactedasrnan—madeantigen．KunMingmicewereinjectedsubcutaneousbytheantigenwiththecarrierproteinofBSA．Andeachgrouphadthe1everofMTinantigenwerec。rresponding8垤／mo址se、16腿／Ⅱlouse、32腿／mouse、64腿／豫ouse、128炫／mouseinthefirstimmunity．ThequantumofMTinantigenisdoublinginthelatterboostingi

7、砌unityinturn．TheantigenhadbeenemulsifiedwithFreund’scompleteadjuvantintheearlier3timesandwithFreund’sincompletead{uvantinthelatter3times．ThetwobatchesofmousewereboostedwiththesaJIleconditionexceptdifferenttimebetweentwoiⅡlIIlunities，onewas10d