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时间:2019-05-16
《Zn金属硫蛋白间接竞争型ELISA的建立与应用》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、要ELIsA以其快速、准确、安全、简便的特点而成为定量测定生物体内微量有机物的理想方泫。木实验的爵的就是为了建立一套快速、有效、方便并熊定量测定猪体组织中MT含量的ELIsA法,为动物科学中的研究和应用提供MT的定量测定技术。1.猪MT抗小鼠抗血清的制备:用戊二醛法将纯品zn—MT与载体蛋白(BsA)偶联后,作为人工抗原,对昆明小鼠皮下注射。首次免疫时抗原中MT量分别为8ug/只、16ug/只、32ug/只、64ug/只、128ug/只;加强免疫时所用抗原量依次加倍。前3次免疫时采用的是弗氏完全佐剂乳化,后3次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化。两批小鼠拥强免疫的肘间隔分别为lO日和14
2、且。用免疫双扩教方法测定抗血清效价。得出以下结论:当首次免疫抗原中MT的量为16—32ug/只,每次加强免疫时抗原量加倍,加强免疫间隔时间为10日时,其免疫效果较佳,可使大部分小鼠抗血清效价达到l:16以上。2.抗体的纯化及鉴定;将效价达到l:16以上的MT小鼠抗血清用饱和硫酸铵盐析法浓缩出Y一球蛋白,然后用DEAE—sephadexA50层析柱分离提纯IgG。实验中发现洗脱液pH值为7.4时洗脱第一峰即为纯化的IgG,用不连续缓冲系统聚丙烯酰胺凝胶浓度梯度龟泳鉴定层析洗脱下的!gG达到屯泳纯。对纯化后的IgG进行辣根过氧化物酶标记,用直接ELISA鉴定其为MT的特异性抗体。3.
3、ELISA的建立:运用固相抗原间接非竞争型ELISA和固相抗原间接竞争型ELIsA检测猪体组织中部分样品MT的含量,结果表明;用间接非竞争型ELIs^测定样品时其结果不够稳定。同一样品所对应的oD值相差较大,此方法仅适合于样品中MT定性检测;采用间接竞争型ELIsA测定样品,0D值比较稳定。用方阵滴定法确定了间接竞争型ELISA的各项具体条件:抗原最佳包被浓度为6.25ug/ml,一抗(鼠抗猪)使用适宜浓度为50ug/mI,酶标抗体(山羊抗小鼠)的使用浓度为i/8000倍,反应时间为3hr。用标准MT,采用间接竞争型ELIsA方法拟合的标准曲线回归方程为:y=105×2“。””“
4、”“’,相关系数为:R-o.9592。本方法的灵敏度为4.1ng/ml,批间和批内变异系数为9.9760%.14.385896,在实际应用中有较好的稳定性。说明本试验建立的间接竞争型ELIs^具有特异性强、灵敏度较高、稳定性和重复性好、适合于大批量样品的检测等优点,不失为对MT进行定量分析的一种有效方法。关键词:金属硫蛋自抗体:金属硫蛋自:闼接竞争型£LIsA;阐接菲竞争型ELIsA;免疫AbstractELISAisbecominganoptimalmeFhodthatcoulddeterminethequantumoforganiccompoundinorganismbeca
5、useofitsspeediness,specificityandsensitivity.Thepurposeofourresearchwastoestablishasetofc。f『Ipleteassaydeteminedquantu讯。fmetallothioneinins再in8’sbody.1.thepolyclonalanLiseruminmiceofMTwhichwasdist“ledfromswinewasprepared:AftertherarefiedMT—11wascoupledtocarrierproteinBSAbymeansofGD,theprotein
6、—haptencunjugateswasactedasrnan—madeantigen.KunMingmicewereinjectedsubcutaneousbytheantigenwiththecarrierproteinofBSA.Andeachgrouphadthe1everofMTinantigenwerec。rresponding8垤/mo址se、16腿/Ⅱlouse、32腿/mouse、64腿/豫ouse、128炫/mouseinthefirstimmunity.ThequantumofMTinantigenisdoublinginthelatterboostingi
7、砌unityinturn.TheantigenhadbeenemulsifiedwithFreund’scompleteadjuvantintheearlier3timesandwithFreund’sincompletead{uvantinthelatter3times.ThetwobatchesofmousewereboostedwiththesaJIleconditionexceptdifferenttimebetweentwoiⅡlIIlunities,onewas10d
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