转染反义cerbB2+mRNA对子宫内膜癌ISHIKAWA及HEC1A细胞株生长抑制作用的研究

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1、转染反义c—erbB-2mRNA对高分化子宫内膜癌ISHIKAWA及中分化HEC一1A细胞株生长抑制的研究目的基因的突变及过渡表达导致的癌基因激活是多数肿瘤发病的重要因素。由于mBNA较DNA更易有效地进行操控，因而通过阻断基因的蛋白合成来有效地抑制相关基因就成为最近研究的热点。目前，通过阻断已发生突变或过渡表达基因mBNA的方法在治疗肿瘤、心血管性疾病及病毒性疾病等的研究中已有大量的报。反义技术具有选择性高、对靶目标亲和力强、生效快速、机制确切、易于操控及副作用少等特点，从而使其成为目前有效地抑制相关基因的常用的方法，并且在乳腺癌及

2、卵巢癌等肿瘤的研究中已取得了可喜的成果。然而，在子宫内膜癌的研究中还未见相应的报道。已知c—erbB一2(HER一2／neu)是子宫内膜癌主要的原癌基因，在内膜癌的生物学行为中起着重要的作用，其过度表达是内膜癌预后不良的重要因素。因而，本研究的目的即为评价转染c—erbB一2反义寡核苷酸(antisel'lseoligonucleotides，ASODNs)对高分化子宫内膜癌ISHIKAWA细胞株及中分化子宫内膜癌HEC一1A细胞株生长抑制作用的效果。方法1．C·erbB-2在子宫内膜癌中的表达以及与内膜癌临床病理因素之间的关系免疫组

3、化：通过免疫组化S—P方法检测C—erbB一2蛋白在10例子宫内膜不典型增生及31例不同期别、不同组织分级、不同肌层浸润深度的子宫内膜癌组织中的表达，分析其表达强度与子宫内膜癌临床及病理因素之间的关系o2．转染反义c—e南B一2mRNA对高分化子宫内膜癌ISHIKAWA细胞·1，株及中分化HEC一1A细胞株生长抑制作用的研究2．1细胞培养将ISHIKAWA及HEC一1A细胞培养于含10％胎牛血清(Gibco)及50一ml青霉素和链霉素的DMEM(Gibco)培养基中。孵箱温度为37℃，C02浓度为10％，每周传代2次。培养细胞用于各项

4、实验研究o2．2免疫组化ISHIKAWA及HEC—IA细胞培养于盖玻片48h，待玻片细胞融合率达75％以上后，采用S—P法免疫组化检测c—erbB一2蛋白在细胞膜上的表达情况o2．3C—erbB一2ASODNs转染ISHIKAWA及HEC—IA细胞上述培养细胞于对数生长期，经0．25％胰酶消化后加入DMEM培养基制成单细胞悬液。计数后，接种于96孔板，每孔接种5×103个细胞加100ulDMEM培养基，培养48h，待细胞融合率达90％以上时进行转染。转染试剂为Lipofectamine2000。2．4透射电镜观察各组细胞超微结构的变化

5、两种培养细胞于对数生长期经0．25％胰酶消化后，DMEM培养液制成单细胞悬液，接种于A、B、C、D、E及a,b、c、d、e、10个培养瓶内(75cm2)，每瓶接种细胞数为1×107，加20mlDMEM培养液，培养48ho待融合率达90％以上后，吸净培养液，5mlDM液轻轻冲洗细胞表面2次oA／a瓶内加入lOmlDM液，作为正常对照oB／b、C／c、D／d瓶分别加入10mlDM液稀释的浓度为0．3uM的ASODNs／lipofcctamine2000转染液、ASODNs对照液、SODNs／lipofectamine2000转染液，E／e

6、瓶加入lOml相应浓度的lipo-fectamine2000对照液。培养24h后，每瓶再加入10ml含10％胎牛血清及抗生素的DMEM培养液，继续培养48ho收集细胞行透射电镜检测o2．5流式细胞仪检测细胞凋亡将两种细胞接种于6孔板的5个孔内，标记为A1／al、B1／bl、C1／cl、D1／dl、El／elo每孔细胞密度为1×106oA1／al、B1／bl、C1／cl、D1／dl、El／e1分别为正常对照，ASODNs转染，ASODNs对照，SODNs转染，及lipo-fectamine2000对照。转染浓度为0．3uMo转染后收集细

7、胞经流式细胞仪检测细胞凋亡o2．6RT—PCRassay细胞培养、转染及细胞收集同流式细胞术步骤，每一标本含lxl06个细·2．胞。转染细胞消化、收集、洗涤、沉淀后以Trizol(Invitrogen)试剂提取各标本总RNA(详见试剂操作说明)o采用TaKaR且试剂盒(AMY，TaKaRaBio．，Japan)行RT—PCR检测C—erbB-2mRNA表达变化情况o2．7westernblot分析细胞培养、转染、收集及洗涤同电镜步骤。每一标本1×107细胞。转染后的细胞行westernblot检测c—erbB-2蛋白表达的变化。结果1

8、．C—erbB-2在子宫内膜癌中的表达以及与内膜癌临床病理因素之间的关系1．1c—erbB-2在子宫内膜非典型增生及子宫内膜癌组织中的表达C—erbB-2在子宫内膜非典型增生及内膜癌组织中的阳性表达率分别为40％及58％