PPM1M对NFκB信号通路调控作用的研究

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1、摘要核因子俎(nuclearfactor-r,B，NF-r,B)信号通路活性受到细胞质多种蛋白的精细调控，NF．rd3与这些蛋自质组成了NF．rd3系统，多种因素可引起NF．娼信号转导途径的激活。NF．rd3调控大量基因的转录，特别是一些涉及免疫应答和炎症应答的基因，NF-rd3信号通路参与了炎症、细胞增殖、细胞凋亡等方面的调控，萄前所知的NF．r,B所诱导表达的基因大多与细胞的生长和存活有关。蛋白磷酸酯酶2C(proteinphosphatase2C，PP2C)家族成员大多与细胞生长和细胞应激应答的信号通路相关，其中金属依赖性蛋自磷酸酯酶1A(meta

2、l．dependentproteinphophataselA，PPMlA)、PPMlB、PPMlL、PPMlF、PPMlE、整联蛋白偶联激酶相关的磷酸酯酶(integrin-linkedkinase-associatedphosphatase，ILKAP)等PP2C家族蛋白成员直接参与了NF．r,B信号通路主要路径或旁路的调控，但是PP2C蛋自家族蚤自成员PPMlM的底物与生理功能却尚未证实，基予PPMlM的结构和序列与上述PP2C家族蛋囱的相似性，我们检测了PPMlM在NF．进信号通路中的功能。我们采用RNA于扰(RNAinterference，RNA

3、i)技术抑制PpMlM的mRNA表达，从而研究其在NF．rd3信号通路中的作用。本实验从3条不同的靶向PPMlM的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)qb筛选出最有效瓣l条siRNA，嚣PPMlMsiRNA_I，并且用PPMlMsiRNA_I干扰PPMlM后发现抑制PPMlM的表达会降低NF．xB信号通路的活性。我们表达并纯化了PPMlM．GST融合蛋白以用于PPMlM与NF-l：信号通路中蛋白相互作用的研究。另外，本实验还检测了肿瘤坏死因子畎tumornecrosisfactor-a，TNFa)在Hela细胞中时间梯度的刺

4、激效应，结果发现，从0分钟到30分钟核因子KB抑制子a(inhibitorofnuclearfactor-r,B0【，Ir33a)的表达量逐渐下降，而60分钟时Ir,Ba的表达量开始上升，因此我们选择30分钟作为PPMlM定位实验的TNFa刺激时闻。在免疫荧光蛋卷定位实验中我们发现：在Hela细胞中，非刺激状态和刺激状态下PPMlM均定位于细胞质孛，因此我们在穗互作用实验中选择NF．r,B信号通路细脆震部位的蛋白作为靶点，并且发现肿瘤坏死因子受体相关因子2(n幢receptorassociatedfactor2，TRAF2)、核因子避抑制子激酶13(in

5、hibitorofnuclearfactor-r．Bkinase13，IKK§)和p52与PPMlM均有裙互作用。本实验的研究为PPMlM功能的进一步研究提供了新思路。摘要关键词：RNA干扰核因子心金属依赖性蛋白磷酸酯酶1M蛋自定位肿瘤坏死因子受体相关因子2核因子避抑制子激酶pp52llAbstractABSTRACTManyproteinsparticipateintheregulationoftheactivityofnuclearfactor-ld3(NF—kB)inthecytoplasm，theseproteinsandNF—kBcompose

6、ofNF—kBsignalsystem．NF—kBsignaltransductionpathwaycallbeactivatedbymanykindsoffactors．NF·kBregulatesthetranscriptionofanexceptionallylargenumberofgenes，particularlythoseinvolvedinimmuneandinflammatoryresponses．NF-r,Bparticipateintheregulationofinflammation,cellproliferationandapo

7、ptosis．IthasbecomeclearovertheyearsthatNF-1cBisapleotropictranscriptionfactorinvolvedintheinducibleexpressionofawidevarietyofgenes，particularlythosethatpromotecellgrowthandsurvival．Amajorityofproteinphosphatase2C(PP2C)familymembersparticipateintheregulationofcellgrowthandincellul

8、arstresssignaling，andthePP2Cfamilymember