实验五、叶绿体的分离与观察

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1、实验六叶绿体的分离与观察叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。实验目的1.通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并了解荧光显微镜的使用方法。实验原理组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

2、LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation试剂与器械1.器材:普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。烧杯2个,250ml量筒1个,滴管20支,10ml刻度离心管20支,试管架5个，纱布若干，载片和盖片各4片。2.试剂:0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridineorange)。三.实验步骤（一）叶绿体的分离与观察1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml0.35mol/LNaCl溶液中，装入组织捣碎机。2.利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。3.将匀浆用6层纱布过滤

3、于500ml烧杯中。4.取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。5.将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。6.将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。（二）菠菜叶手切片观察新鲜菠菜叶↓刀片切出一斜面置于载玻片上↓滴加1~2d氯化钠溶液↓盖上盖片显微镜下观察实验结果（一）叶绿体的分离和观察1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2.以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(b

4、ule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。3.加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。（二）菠菜叶手切片观察1.在普通光镜下可以看到三种细胞(1)表皮细胞:为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞;(2)保卫细胞:为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞:为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。2.在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱,气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞

5、少。3.用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光,气孔仍为绿色。3.用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光,气孔仍为绿色。作业1.根据荧光观察结果，绘制菠菜叶气孔的结构模式图。思考题：1.叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意些什么问题？五.实验结果1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2.用目微尺和台微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测量5-10个叶绿体，求其平均值。六.思考题分别计算不同物镜放大倍数下测微尺的单位。2.鸭红细胞直径为多少微米.