实验五 叶绿体的分离

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1、山东大学实验报告2013年3月12日姓名李某某系年级同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体的分离、纯化与荧光观察学号201100140000【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。【实验原理】1.叶绿体分离原理匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。差速离心：颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的密度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度不

2、同，先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液中（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。2、差速离心特点：1.介质密度均一；2.速度由低到高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞核、细胞器。沉降顺序：细胞核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核蛋白体。可将细胞器逐步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。3、密度梯度离心密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯

3、度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中，这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种，速度沉降主要用来分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的，由于具有这一重要功能，所以它一直是植物生物学、细胞生物学和分子生物学的重要研究对象，叶绿体是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。4、吖啶橙（1）探针特性AO是三环杂芳香类荧光

4、探针，既可以标记DNA，又可以标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光。AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核酸的磷酸发生静电间相互作用。强结合方式：又称插入性方式，AO分子插入在双链核酸的碱基对之间，它们的结合能量为6—10kcal/mol探针，插入后的探针分子与核酸结合更加稳定，每插入一个AO分子，双链结构即发生26度旋转，这样在一个位点上就限制了AO分子与DNA的结合，其荧光发射峰为530nm，呈绿色荧光。弱结合方式：即静电吸引结合方式，带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸根结合，每个磷酸

5、根的位点上均可结合一个AO分子，最大结合率为1:1，这种结合方式主要是AO分子与RNA分子的结合，其发射波长为640nm，呈红色荧光。AO与核酸的结合方式在低浓度下最佳，此时插入性结合方式占优势。（2）AO的主要应用：1.对细胞内单链或双链DNA/RNA定性和定量。2.分析核酸内部结构及含核酸的细胞成分构象。3.观察DNA凝胶电泳情况。4．作为细胞内PH梯度显示剂，用来检测离子交换，钙离子通道的质子梯度变化等。5、荧光的概念光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态到基态时，可以电磁辐射的方式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外

6、辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极端的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光称为荧光，一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光等，称为自发荧光。某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这种荧光称为诱发荧光，如叶绿体被吖啶橙染色后可

7、发橘红色荧光。6、荧光的性质1.吸收光，必须有激发光源。2.荧光波长>激发波长（损失热能）。3.荧光强度极小于激发光的强度。4.有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光、淬灭剂等，先拍照后观察）。5.荧光强度取决于激发光强度、被捡物浓度、荧光效率（在制作荧光纤维标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油）。7、荧光显微镜的操作及注意事项（1）接通电源，打开启动装置开关；（2）按starter按钮3~5秒以启动激发光源，注意：按starter按钮不能超过5秒，启动2~3分钟后方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦关闭汞灯，3分钟内不得重新启动，用完后关闭ma

8、inswitch；（3）光路对中（换灯泡时进行）；（4）选择相对应