耐氟康唑白念珠菌ERG11基因突变及其基因型与耐药性的关系研究

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1、中山太学硕士学位论文中文摘要耐氟康唑白念珠菌ERGll基因突变及其基因型与耐药性的关系研究专业名称：内科学学位申请人：黄静指导老师：张天托教授摘要近10余年来，随着器官移植的普遍开展，恶性肿瘤，艾滋病的不断增多，大量使用广谱抗生素，免疫抑制剂，类固醇药物，抗癌的放疗与化疗，深部真菌病，尤其是因白念珠菌感染所致的深部真菌病正逐年增加。氟康唑是目前用于治疗深部真菌病的重要抗真菌药之一，从1988年上市以来，因具有吸收好，抗真菌谱广及毒性小等特点，在l临床上得到了广泛应用并取得了良好的治疗效果，但因氟康唑仅具抑菌作用，疗程需较长，渐

2、导致耐药真菌的增多，造成了沉重的经济负担及资源浪费。为此，由于耐药性引发的临床治疗失败，以及由此可能造成的院内传播和感染所带来的的严重问题引起了大家的r“+泛关注。防止和延缓耐药性的产生，了解耐药性产生的分子机制及开发新型抗真菌药物是国内外研究的重点。目前在我国缺乏对念珠菌的大规模药敏监测报告，对真菌的耐药机制研究报告相对较少，为此我们进行了下列研究，目的在于：(1)通过收集耐药菌株，调查深部念珠菌感染的菌种分布和对氟康唑的耐药性；(2)基于临床上耐药标本的收集较为困难，探索体外诱导真菌耐药突变菌落的经济、简便的方法，为进行耐

3、药性研究提供实验模型；(3)对耐氟康唑白念珠菌的药物靶酶编码基因(ERGll基因)进行分析，了解白念珠菌对氟康唑的耐药分子机制；(4)采用AP—PCR基因分型方法来探索白念珠菌耐药表型与基因型的关系，可为监测耐药菌株的分子流行病学提供一种新的方法，也将深化白念珠菌耐药性的分子机制研究。中山大学硕士学位论文中文摘要材料与方法1、念珠菌的检测及对氟康唑的耐药性研究临床标本收集：临床标本采集时间为2000年6月--2004年2月，种类包括疑为深部真菌感染患者的痰液、咽拭子、血液、胸水、腹水、脑脊液、尿液、深静脉导管拭子、阴道拭子等。

4、标准菌株：ATCC90028，ATCC64550，ATCC22019。念珠菌的分离采用沙堡氏培养基并经形态学确认。种类鉴定采用科玛嘉显色培养基，对氟康唑的药敏试验采用了2002年NCCLS认可的酵母菌纸片扩散法。采用Etest法检测了7株耐氟康唑的白念珠菌对其它抗真菌药如二性霉素B，酮康唑、伊曲康唑、5一氟胞嘧啶的敏感性。2、氟康唑体外诱导产生白念珠菌耐药株的实验研究受试菌株：为我科实验室分离的对氟康唑敏感白念珠菌Call3和标准菌株ATCC90028。试验前采用NCCLSM一27A方案，以试管稀释法对实验菌株进行了药敏实验。

5、诱导方法：通过配置含氟康唑不同药物浓度梯度的培养基，反复多次连续接种传代的方法，采用纸片扩散法监测诱导菌株对氟康唑的耐药性，以NCCLSM-27A法逐步测定菌株的MIC值，保留不同MIC值的菌株，直到MIC值上升达到64ug／m1以上。成功诱导后，再测定耐药突变菌落的遗传稳定性及对其他抗真菌药物包括伊曲康唑、酮康唑、咪康唑、两性霉素B、氟胞嘧啶的耐药性。3、耐氟康唑的白念珠菌ERGl1基因突变情况研究受检菌株：为我院2000年6月至2004年2月从痰液、血液、体液，尿、阴道拭子、咽及口腔拭子等标本中分离并经NCCLSM～27A

6、方案确定其对氟康唑的MIC值≥64lIg／ml耐药菌株；2株经体外诱导成功的耐药株及其母本。一株MIC=32ug／ml的标准菌株ATCC64550。引物设计：采用PrimerPremier5．0软件，选择氟康唑的作用靶酶一白念珠菌羊毛固醇14a一去甲基酶(14a--DH)的编码ERGll基因序列(GenBankX13296)为模板自行设计两对引物，以扩增包含突变热点区在内的基因序列。白念珠菌DNA模板的制备：采用酶消化和碱裂解法。II中山土学硕士学位论文中文摘要PCR扩增的ERGll基因、产物分析与测序：ERGll基因经PCR

7、扩增后，产物采用琼脂糖凝胶电泳法，，在含0．5Itg／ml溴乙锭的1．2％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像系统观察结果并照相后切胶回收纯化，用双脱氧链末端终【_

8、二法正反双向测序，结果经Edit—Seq和DNAStar软件拼接后与GenBank提供的ERGll基因序列进行对比分析突变情况。4、白念珠菌AP—PCR基因分型与耐药性关系研究标准菌株为ATCC90028，ATCC64550(MIC=32pg／m1)。受检菌株共；8株，为2002年6月至2004年2月从临床标本中分离的白念珠菌，其中包括7株耐氟康唑白念珠菌。2株体外诱导的

9、耐氟康唑白念珠菌。DNA模板制备采用酶消化和碱裂解法。基因分型采用AP—PCR方法。随机引物选择为引物1251。经AP--PCR扩增后，产物采用琼脂糖凝胶电泳法，在含0．5ug／ml溴乙锭的经1．5％琼脂糖电泳后，用凝胶成像系统观察结果并照相，对其中30株菌重复实验两次。最后