骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究

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1、骨髓阐充质千细胞分化为。飘细跑的实验研究骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究硕士研究生；导耀：管慧红陈运煲鹾究爨中山大学附属第一医院血液内科，广州510080摘要慰心瘸是～静严黧筑害天类健壤的常见疾瘸，惫性心腿攫骶佟先冠心麟中最危重翡籁床类墅，是遮藏嚣必凌恚黉死亡静主要藤嚣。近霉来髓蔫奔入治疗、冠状动脉旁路移植术等在临床的应用，急性心肌横张的急性死亡率有了一定程廉的下降，但患喾最终残予心力衰竭蛉避期死亡率并寒降低。其原圜在于心腿援强后残蟹筑心瓤缀程由予代髅两发生§基嚣，号i超心室霪梅，迸夏继健心力衰竭靛黢生。目前临脒上心肌梗死的治疗包括药物治疗、介入治疗和手术治疗，

2、在一定程廉上可改善心彤l缺盘，挽救一些濒死静心腿细胞，僮荠不熊修复坏强匏心肌，因藤不镜竣蔽本主嘉效藐壹发室重穆彝心力衰疆翡发生。凝鬻瑷来+久粕谈惫心飘缀藏是永生细胞，坏死后不可再生。虽然新近有研究撼示，心梗腊谯心肌梗死灶边缘及正常心舰组织中蠢少慧心胍缨腿娆发生有丝分裂，但其分裂增醢能力极低，难竣有效黪复坏琵心飘。嚣髓裁充餍鼍=壤麓(mesenchymalstemcells，MSCs)是骨髓干细胞的重要组成部分，具有强大的分裂增髓能力，在体外培养可经历移次传代藤不发生衰变。眷研究发现MSCs在特定壤豁条俘中可分纯为戏心腿缌艇；在心驻髓帮注射MSCs，氇能在心疆内分往蠹戚熟

3、游心瓤蠡巍。出于MSCs疑存区大的增髓能力，可以通过体外培养扩增获得充足数量的细胞，用之移植给急性心舰梗死患喾，有可能修燹患者的横鼹心腿，防止心室重鞠及心力衰竭，为人们治疗心飘攒廷提袋一耱鞭的治疗手段。僵交予心黥霸部注射MSCs是一释翻衔瞧荫骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究治疗，具有一定的风险，因此需要寻找一种简单、安全、有效的移植方法。为证实骨髓MSCs向心肌细胞分化的潜能，并探索通过静脉输注进行MSCs移植的可行性，本研究首先在体外用药物诱导分化骨髓MSCs，确定MSCs能在某种药物作用下向心肌细胞分化的潜能；然后复制心肌梗死大鼠动物模型，并经静脉注射体外扩

4、增的骨髓MSCs，了解体外扩增的Mscs能否在心肌损伤的病理状况下经静脉输注后迁移至梗死心肌组织中，并进一步在心脏病理微环境作用下向心肌细胞分化，希望能为临床应用骨髓问充质干细胞移植治疗心肌梗死提供实验依据与理论基础。第1章体外定向诱导骨髓MSGs向心肌细胞分化1．目的确定骨髓MSCs向心肌细胞分化的潜能。2．材料与方法3～4周龄Fischer344大鼠，雌雄不拘，断颈处死后取其股骨，用含10％胎牛血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔获得骨髓细胞，用吸管转移细胞至培养瓶，通过传代培养获得纯化的mSCs，然后加入不同浓度的5一氮胞苷(5-aza)定向诱导分化MSCs。在此过程中

5、密切观察细胞发生的形态变化，并通过细胞酶免疫化学检测诱导分化后的MSCs是否表达成熟心肌细胞特异性蛋白——一tl,肌肌钙蛋白T(cTnT)及结蛋白(desmin)。3．结果加入5-氮胞苷24h后，20umol／1浓度组发生明显的凋亡，细胞由长梭形变为圆形，折光性消失，胞核固缩，结构松弛，逐渐失去贴壁能力脱落于瓶底，悬浮于培养液中：1W后细胞凋亡百分比约占75％以上。1W时，未加药物组、5umol／L、10umol／L浓度组细胞仍呈梭形生长，形态未发生明显变化；2W时，2瞥髓间克壤干细胞分化为，o肌细胞的实验研究药物诱母组细胞形态殷生改变，由梭形变为圆形、椭圆形、键棒状或

6、柱状，细胞商激含麓势，可觅2一《拿麴鼹棱。酶免疫缀爨诧掌捡溅显示，t释对5umol／L、i0umol／L浓度组心肌肌钙臻白T(cTnT)及结蟹囱(desmin)染色阳性，但刚性率较低，仅占20％左右：雨2w及4w时cTnT及desmin染色阳瞧搴明显璃赢，转就率麓达so％；来鸯器药躲组络魏无褡缝没鬟。4。缝论燕体外用药物定向诱导分纯骨徽MSCs，诱导恁豹细胞哥淡达心舰特异性添童——心航瓿钙蛋自T(aTnT)和结蛋囱(desmin)，证鞠嚣髓MSCs其有向心肌镪胞分化的港熊。第2章电凝烧灼法制作大鼠心勰梗毙动襁模型i。毯的探讨～种新韵大鼠心瓿梗死动物模型稍作方法。2．材料

7、与方法继滚Fischer344大鬣弱只，襄簿屠经强蹙撩管连遴凌耪详蔽梳，韬歼藤簿黎露心霆爨，电凝髓灼葵左悉状秘赫藏骚支，并予拳藏拳薏记录I{辱联心意强。对照组健搿冠状动稼貉芤法制律心腻梗琵模型。然厝于12h、24h、48h分抚处死大鼠，取出心脏，显微镜下观察其病理变化。3．缕浆与术前心电图棚比较，术后两缀大鼠均可见QRs波峰略降低，T波高簿，提示存在。§戤淤盘。在魄凝魏鹳丈鬣辩穰动躲磊，丈鬣心瓿爨躐凝蠢馕坏凭，继磊3骨髓黼充霞干细穗分化为≈飘细胞的实验研究有肉芽组织长入梗死灶内，最后形成瘾痕，证明鼹辨方法均能成功复制心肌梗死动辍援型。与冠