催产素体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究

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1、河北医科大学硕士学位论文催产素体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究姓名：王浩宇申请学位级别：硕士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：张雷；王海萍201203中文摘要催产素体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究摘要目的：由动脉粥样硬化而引发的缺血性心脏病，极易诱发急性心肌梗死，是严重危害人民健康的多发病。细胞性心肌成形术可以从根本上实现心肌细胞的结构修复和功能恢复，是一种目前改善心梗患者心功能较有前景的治疗手段。选择恰当的“种子”细胞是决定细胞性心肌成形术成功与否的关键，骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMS

2、Cs)作为组织工程重要种子细胞，具有分布广泛、取材方便、易分离扩增、低免疫源性、易被外源基因转染等诸多优点，成为近年来国际上广为关注的焦点。本实验通过体外分离培养SD大鼠的BMSCs，并用催产素(Oxytocin，OT)诱导向心肌方向分化，对分化过程进行细胞形态学、心肌特异基因及转录因子表达加以分析研究。以对OT诱导BMSCs向心肌细胞分化做初步探讨，为进一步研究利用BMSCs来源的心肌细胞应用于临床修复受损心肌奠定基础。方法：1BMSCs诱导分化利用贴壁分离筛选法从SD大鼠四肢长骨骨髓中分离纯化BMSCs，培养于含10％胎牛血清的IMDM培养液，每隔2d换液，选生长良好的第2代BM

3、SCs分别以含OT0．5x10～vxnol／L、1×10～rmaol／L、3x10。79mol／L的IMDM培养液分组诱导，4d后去除诱导培养基，加入不含OT的培养基继续培养4周。．2免疫细胞化学染色：取各实验组诱导后第28d的细胞，免疫细胞化学染色光镜观察细胞中结蛋白(desmin)、0【。横纹肌肌动蛋白(仪一actin)、P38MAPK、心肌特异性肌钙蛋白(cTnT)和肌钙蛋白。I(cTnI)阳性细胞的表达情况，并统计阳性细胞的转化率。3免疫荧光双标染色技术：取1xlO—pmol／L组培养第28d的细胞爬片，采用C【一actin、cTnT进行荧光双重标记，观察二者在细胞的共表达情

4、况。中文摘要4透射电镜技术：取1×10。7岬ol／L组培养28d的细胞，2．5％戊二醛固定，刮下全部细胞，离心制成细胞团块，常规脱水包埋，超薄切片后，透射电镜观察诱导细胞超微结构。5采用半定量逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，选取1xlO～}tmol／I。组于诱导后第7d、14d、28d，检测G4d3．一4、仅一MHC和Nkx2．5的mRNA表达水平。结果：l免疫细胞化学检测：诱导后各组的BMSCs中均可见desmin、a—actin、eTnT、cYnI$口P38MAPK阳性细胞，各种抗体细胞阳性率中1x10。7mnol／L组明显高于其他组(P

5、免疫荧光双标染色：分化细胞胞浆内仅．actin、eTnT免疫荧光染色呈阳性，有Q．actin表达呈红色，cTnT表达呈绿色，当两者同时观察时重叠的部位变成黄色，提示胞浆中有C’rnT矛0a．actin共表达。3透射电镜观察：分化细胞的超微结构清晰完整，细胞呈条带状，部分细胞表面出现突起；胞核圆形位于细胞中央，核仁明显；胞浆内细胞器丰富，包括高尔基复合体、糖原颗粒、粗面内质网；胞浆内还可见细肌丝样结构平行排列，隐约见明暗相间的横纹。4半定量RT-PCR结果显示：．GATA4．；}DNkx2．5在BMSCs诱导7d后弱表达，14d后表达增强(P

6、在BMSCs诱导7d后不表达，14d后弱表达，28d后表达明显增强(P

7、控。中文摘要关键词：催产素；骨髓间充质干细胞；心肌细胞；细胞诱导分化；全骨髓培养法英文摘要TheExperimentalstudyaboutoxytocininducesdifferentiationofratbonemarrowmesenchymalstemcellstocardiomyocytesinvitroABSTRACTAim：Ischemicheartdiseaseinducedbyatherosclerosiseasilycausesacut