蝴蝶兰外源基因的导入及诱变研究

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1、秦旭颖蝴蝶兰外源基因的导入及诱变研究摘要：蝴蝶兰愈伤组织的诱导实验中，花梗芽经过1％的次氯酸钠处理30min对外植体损伤较小且萌发率较高(85．0％)；6一BA浓度是茎芽增殖的关键因子，其浓度为1Omg／L时，茎芽的数目和质量均较为理想；茎芽顶端叶片诱导愈伤组织，正面放置的叶块诱导愈伤组织的效果优于反面放置的叶块；椰子汁对叶块诱导愈伤组织具有明显的促进作用。外源基因LTP导入蝴蝶兰愈伤组织的实验中，用含AS的OD600值为0．4的新鲜农杆菌对1-2mm的愈伤组织侵染20min，共培养3d为本实验中较合适的处理组合，可获得相对较高的转化率(12．16％)；PCR分子鉴定的阳性苗通过耐寒性实验，进

2、行抗寒性相关的生理指标的测定。通过研究电解质外渗率，叶片丙二醛(MDA)含量，细胞保护酶SOD酶活性，叶片可溶性糖含量以及脯氨酸含量五个生理指标在温度胁迫和恢复培养过程中的变化，表明￡即基因对蝴蝶兰植株的抗冻能力的提高有着重要作用，经过低温培养筛选最后获得89棵转基因抗性苗。在蝴蝶兰愈伤组织的化学诱变实验中，用不同浓度的EMS(甲基磺酸乙酯)来处理3种不同预培养时间的蝴蝶兰愈伤组织，可使部分愈伤白化或褐化甚至致死：采用继代培养l5d的愈伤小块，用0．4％EMS处理2-6h，诱变后平均存活率为56．00％，是比较适合的处理组合，可以获得相当于“半致死剂量”的效应；EMS诱变方向不确定，叶形、叶色

3、，根的数目和粗细等都可能发生变异，诱变谱广。关键词：蝴蝶兰，愈伤组织，脂质转移蛋白基因(z胴，耐寒，甲基磺酸乙酯(EMS)，化学诱变扬州大学硕士学位论文．2．Exogenousgenetransferandmutationanalysis‘PhalaenopsinSI’SrhABSTRACT：InordertooptimizetheconditionsforPamabiliscallus-inducement，severalfactorsknowntoinfluencecallus—inducementwereexamined．。Exposuretosodiumhypochloritefor3

4、0minwasfoundtobethemostsuitabledisinfectionduration；a15mg／L6一BAwasoptimalforstembudproliferation；face—upplacementofexplantsinthemediumresultedinasignificantincreaseinthenumberofPLBsformedcalliperleafblock(14versus7incontr01)；coconutmilk，whensuppliedat20％(v／v)andcombinedwithTDZcouldserveasausefuladdi

5、tiveforelevatingformation．Anefficientgenetictransformationsystem，usingAgrobcIcteri“mtumefaciens-mediatedT-DNAdelivery，isdescribed．Leaf-derivedembryogeniccalliwereCO-cultivatedwithA．tumefaciensstrainsharboringthebinaryvectorpCAM2300．Transformationefficiencywasaffectedbythesizeofcalli，andtheconcentrat

6、ionofA．tumefaciens，andthedurationofCO—cultivation．Thetransformationfrequencycanachieve12．16％whenCO-cultivationfor20minandO．4(OD600)ofA．tumefacienssuspensionwith1—2mmcallus．IntegrationofT-DNAintothegenomeofputativetransgenicplantswasconfirmedbyPCRandSUbjectedtocold-tolerance．Inresponsetocoldacclimati

7、on，fivephysiologicalindicatorsweremeasuredwithstepwisechangeoftemperature，i．e．，electrolyteleakage，activityofsuperoxidedismutase(SOD)，contentofmalondialdehyde(MDA)，prolineandtotalsolublesugars．Conclusi