产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药性及其分子流行病学研究

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1、中山大学硕士学位论文中文摘要产ESBLs肺炎克雷伯茵的耐药性及其分子流行病学研究专业：内科学硕士生：符永玫指导教师：张扣兴教授摘要【研究背景】肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K．pneumoniae)为革兰阴性菌，属于肠杆菌科克雷伯菌属，其广泛分布于自然界，是人类呼吸道和肠道的常居菌，常导致呼吸道、泌尿道、消化道和皮肤软组织感染及败血症等，近年来已成为仅次于大肠杆菌的最重要的条件致病菌之一，在医院获得性感染中占有非常重要的地位。随着抗生素在临床上的广泛使用，肺炎克雷伯菌对抗生素的耐药状况日趋严重，由耐药菌株导致的医院感染发

2、生率逐年上升。p．内酰胺类抗生素是治疗肺炎克雷伯菌感染的有效药物，然而随着D．内酰胺类抗生素尤其是第三代头孢菌素在临床上的大量应用，肺炎克雷伯菌对其耐药性也逐年提高，给临床抗感染治疗带来了极大挑战。产超广谱p．内酰胺酶(extended—spectrumlB-lactamase，ESBLs)是肺炎克雷伯杆菌对p．内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一。ESBLs是细菌产生的能水解大多数青霉素、头孢菌素和氨曲南等p．内酰胺类抗生素且活性能被酶抑制剂(如克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦)抑制的一类p．内酰胺酶。ESBLs主要由质粒介导，易在同种属或不同种属细菌之

3、间水平传播引起产酶菌医院感染的暴发流行，而且中山大学硕士学位论文中文摘要产ESBLs细菌的质粒常常携带氨基糖甙类、氯霉素或磺胺类抗生素耐药基因，使产ESBLs菌株呈现多重耐药性，进一步加大了临床治疗的难度。由于不同国家和地区的抗感染治疗策略不同，临床抗生素的使用管理亦有差别，常导致不同地区产ESBLs肺炎克雷伯菌流行的基因型和耐药性也存在差异。因此，了解本地区甚至本院产ESBLs肺炎克雷伯菌对常见抗生素的耐药性及耐药谱特征，在基因水平上检测ESBLs的编码基因，分析ESBLs在肺炎克雷伯菌中的流行基因型，可以有效指导临床抗生素的合理使用，并对预防

4、和控制肺炎克雷伯菌耐药菌株的传播和流行也具有非常重要的意义。【目的】1．了解中山大学附属第三医院临床分离的肺炎克雷伯菌中ESBLs的流行情况及其对常见抗生素的耐药谱特征，以指导临床合理选用抗生素。2．采用PCR法对肺炎克雷伯菌携带的ESBLs耐药基因进行初步分型，并对部分产ESBLs菌株进行DNA测序以确定其基因亚型，了解中山大学附属第三医院产ESBLs肺炎克雷伯菌的分子流行病学特征。【材料与方法】l产ESBLs肺炎克雷伯菌流行状况及耐药性1．1受试菌株：2007年1月至12月中山大学附属第三医院临床分离的非重复肺炎克雷伯菌107株。1．2ESB

5、Ls的表型筛选与确证试验：采用CLSIMSl00．15文件(2005年版)推荐的ESBLs的表型筛选与确证试验。1．3药物敏感性试验：采用K．B(Kirby-Bauer)纸片法检测107株临床分离肺炎克雷伯菌对20种常见抗生素的敏感性，按CLSIMSl00—15文件(2005年版)标准判断结果。1．4统计分析：采用办公软件MicrosoftExcel2003和统计学软件SPSSl3．0对肺炎克雷伯菌的药敏试验结果进行统计分析，产ESBLs菌与非产ESBLs菌株敏感率之间的比较应用Z‘检验，P<0．05有统计学意义。2产ESBLs肺炎克雷伯菌的分子

6、流行病学研究中山人学硕士学位论文中文摘要2．1受试菌株：ESBLs表型确证试验阳性的肺炎克雷伯菌共46株。标准菌株：TEM．3、SHV-18、CTX-M．3、CTX-M．5、CTX．M．8等产ESBLs标准菌株。2．2DNA模板的制备：采用煮沸裂解法制备DNA模板。2．3引物设计：参照文献设计5组常见的ESBLs基因引物：TEM型及SHV型通用引物各一组；CTX．M型设计3组引物，分别为CTX．M．Ga包括CTX．M一8、9、13、14、16~19及Toho．2亚型：CTX．M．Gb包括CTX．M．2、4~7及Toho．1亚型：CTX-M—Gc包

7、括CTX．M．1、3、10--12、15亚型。2．4PCR扩增：ESBLs基因经PCR扩增，产物采用琼脂糖凝胶电泳法，在含O．5／vg／ml溴乙啶的1．5％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像系统观察结果并照相。2．5DNA测序分析：从PCR产物扩增阳性组中每组随机挑选6株送测序公司切胶回收纯化及测序，结果与GenBank提供的ESBLs基因核苷酸序列进行对比以确定其基因亚型。【结果】1．肺炎克雷伯菌中ESBLs产生率为43．O％(46／107)。2．药敏试验结果显示：①46株产ESBLs肺炎克雷伯菌对亚胺培南敏感率最高，为100％，其次为阿米卡星、哌拉

8、西林／三唑巴坦，敏感率分别为82．6％、80．4％，产ESBLs肺炎克雷伯菌对其余17种抗生素敏感率均<60％；②61株非产ESBLs肺