定位于人类17号染色体上新发现的非编码RNAncRNA基因的鉴定及其在神经母细胞瘤中作用研究

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1、·中文论著摘要·定位于人类17号染色体上新发现的非编码RNA-ncRAN基因的鉴定及其在神经母细胞瘤中作用研究刖昌神经母细胞瘤的发病多是由于基因缺陷引起，包括MFCN基因的扩增，l号染色体短臂的缺失，11号染色体长臂的缺失和17号染色体长臂的增添(gmn)。其中，以17号染色体长臂的增添在高风险神经母细胞瘤中最为常见，然而有关候选基因的作用机理至今仍不清楚。在本研究中，我们利用细菌人工染色体(BAC)基因芯片对236例神经母细胞瘤样本进行了比较基因组杂交(array-ComparativeGenomicHybridization，array-CGH)分析，利用

2、涵盖5340个cDNA的基因芯片对136例神经母细胞瘤样本进行基因表达谱分析。综合上述数据，结果发现位于人17号染色体2区5段1带(17q25．1)存在一个新基因。该基因从未被报道过，通过鉴定发现该基因有2个剪切体，即Nblal0727和Nblal2061。NorthernBlot结果提示该基因mRNA转录长度大约为2．3kb，生物信息学分析结果显示该基因不含有长的开放阅读框架(OpellReadingFrame，ORF)，而[35S】-标记的体内、体外翻译实验结果显示该基因不能产生任何的蛋白质产物。这些结果提示了该基因为非编码RNA，由于临床数据显示该基因在

3、恶性度高、预后差的神经母细胞瘤里异常高表达，因此取名为ncRAN(：non-codingRNAexpressedinAggressiveNeuroblastoma)。对70例散发神经母细胞瘤病例进行基因表达谱分析显示，该基因的mRNA高表达与患者的不良预后存在明显的相关性(p

4、Y5Y生长明显受到抑制。由此鉴定，ncRAN基因是定位于人17号染色体上的长的非编码RNA，并在神经母细胞瘤中具有癌基因的特性。实验方法一、临床资料收集的神经母细胞肿瘤样本来自日本多个医疗机构，经手术或是送检而得。236例神经母细胞瘤样本用于比较基因组杂交技术分析，136例样本用于基因表达谱的分析，其中各有112例和70例散发病例。临床标本根据国际神经母细胞瘤分期系统(INSS)进行分类。70例散发病例中临床I期15例，II期8例，III期17例，Ⅳ期25例，IVs期5例，该样本的表达分析用于Kaplan．Meier生存曲线分析。本病例中相对应的MYCN扩增情

5、况已在发表文章中报道。二、方法1、比较基因组杂交技术(array．CGH)和表达谱基因芯片技术利用包涵整个人类基因组的2464个细菌人工染色体(BAC)克隆的生物芯片，对236例神经母细胞瘤进行比较基因组杂交技术分析，分辨率小于1．2Mb。从临床分期不同的神经母细胞瘤组织提取RNA，通过oligo-capping法建立cDNA文库获得5340个eDNA，对136例神经母细胞瘤进行基因表达谱分析，该芯片仅限于日本千叶癌中心研究局的相关神经母细胞瘤研究。比较基因组杂交(array-CGH)和表达谱基因芯片的相关数据可以登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)高通量

6、基因表达数据库(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／geo／)进行查询。相应数据库编号分别为GSE5784和GSE5779。2、细胞培养和转染用含10％灭活胎牛血清及抗生素的DMEM培养基或是RPMll640培养基对NIH3T3和COS7以及人神经母细胞瘤细胞系进行培养。培养环境为37"C，C02分压为5％的细胞培养箱。根据厂家说明，用Lipofectamine2000(Invitrogen)进行COS7和NIH3T3细胞的瞬时转染。3、质粒构建在原发神经母细胞瘤eDNA文库中，克隆出Nblal0727和Nblal2061的cDNA2全长，

7、并将其插入到真核表达载体pcDNA3或是pcDNA3．FLAG质粒中。4、体外转录和翻译禾0用TNTT7Quickcoupledtranscription／translationsystem(Promega)，根据产品说明用[35s]-标记甲硫氨酸对蛋白产物进行标记。之后，对相应的蛋白产物进行SDS—PAGE凝胶电泳和放射自显影检测。5、【35S】．蛋白标记将含有FLAG．ncRAN和HA-MELl的表达载体瞬时转入COS7细胞系。24小时后，lxPBS润洗细胞三次后，加入不含甲硫氨酸和抗生素的新鲜培养基。2小时后，加入浓度为O．1mCi／ml[35S]．标记

8、甲硫氨酸的培养基，继续培养。收集细胞后