骨髓间充质干细胞诱生脂肪细胞及祛脂素去脂化作用的研究

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1、Y935609骨髓间充质干细胞i秀生脂肪细胞及祛脂素去睛化作用的研究计：学位论文：36页表格：6个插图：8幅魏志杰指导教师：宋振岚教授申请学位级别：硕士学位专业名称：内科学论文提交日期：2006年6月论文答辩日期：2006年6月学位授予单位：大连医科大学学位授予时间：2006年6月评阅人答辩委员会主席独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我

2、一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：重魁查查，签字日期：碰年量月上日学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。签字日期：≯卯丘年』月上日骨髓间充质干细胞诱生脂肪细胞及祛腿素去脂化作用的研究硕士研究生：魏志杰指导教师：

3、宋振岚教授专业名称：内科学摘要目的：通过体外分离和浓聚成人骨髓间充质干细胞，定向诱导分化为脂肪细胞，并研究祛脂素对此诱导分化过程的影响，进一步研究观察祛脂素在再生障碍性贫血的去脂化作用，为治疗再生障碍性贫血开辟一条新途径。方法：1．取未累及骨髓的住院患者30例，中位年龄为53．6岁，再生障碍性贫血(AA)患者12例，中位年龄为56．4岁。常规抽取肝素抗凝骨髓液，收集单个核细胞层，按1x106cells／cm2密度接种于培养瓶孵育，5天后更换培养液，弃去未贴壁细胞，3~4天换液1次。实验组：分别将传至第1、3、5代的贴壁细胞按2×105／ml接种

4、于6孔板，370C，5％C02，饱和湿度下孵育，24h后更换培养体系为含有终浓度为1岬ol，L地塞米松、O．5mmol／L的IBMx、10“∥ml牛胰岛素、100mmol／L消炎痛、含lO％FBs的高糖DMEM成脂诱导体系继续培养，诱导3天，每隔3～4天换液1次。对照组：24h后更换含lO“∥ml的牛胰岛素、l∞舒BS的高糖DMEM培养基，每隔3q天换液1次。诱导后细胞用PBS洗涤3次，油红0染色5～10min，光镜下观察。随机数取lO个非重叠视野(×100)，计算脂肪细胞占总细胞数的比例，结果用i±S表示；用免疫组化和RFPCR方法测定两组细

5、胞PPf嘶表达水平。2．随机分为两组，一组为按上述方法继续诱导培养的成脂诱导组；另一组为在成脂诱导体系内加入等体积的终浓度为1m∥ml的祛脂素的实验组。两组细胞的终浓度均为2×105／ml。观察祛脂素对此诱导分化的影响，光镜下观察细胞脂肪化程度，计算脂肪细胞阳性率；RT-PcR测定各组细胞PP舢研表达水平。3．取12例AA患者肝素抗凝骨髓液各约lOml，收集单个核细胞层，洗涤后，调整细胞浓度为4×106／ml，每个AA患者的骨髓均分为等量的两份，再随机分为成脂对照组和祛脂实验组：对照组为将终密度为2×106／ml的贴壁细胞加入上述成脂诱导体系内

6、；实验组为将细胞终浓度为2×106／ml的贴壁细胞加入上述成脂诱导培养体系和终浓度为1m∥m1的祛脂素的混合培养基。接种于培养瓶中，370c，5％的C02，饱和湿度下孵育。每3天半量换液一次。14天后收集培养细胞，在光镜下观察细胞脂肪滴情况和用RT_PCR方法检测两组细胞内PPARl，表达情况。结果：1．光镜下观察MSC诱导为脂肪细胞的形态变化：成脂诱导培养体系加入后48h，成纤维样长梭形细胞样的MSC中有小脂滴出现，主要集中于细胞核周围，随着诱导时间的延长，小脂滴逐渐聚集成大的脂泡，细胞逐渐增大，由原来的梭形变为圆形或多角形。不同代的细胞诱导

7、脂肪的发生率没有明显的区别。对照组诱导3周后无变化，细胞内没有脂滴形成。用油红O染色显示诱导组细胞有棕红色脂肪滴形成：而对照组则没有棕红色脂滴形成。诱导剂组脂肪细胞阳性率为86．4％士3．2％；正常对照组的脂肪细胞阳性率为0％，两组之间有显著性差异(P<0．05)。诱导组细胞PPA聊表达水平比正常组PPf～脚表达水平明显增高，有统计学差异(P

8、测定PPAR_丫蛋白和PP：AR吖mRNA的表达：诱导组细胞PPAR了的表达水平明显高于对照组(P