矮牵牛转ACA与GNA双价抗蚜虫基因的研究

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1、摘要：矮牵牛(Petunfahybrida)花大色艳花色丰富，为长势旺盛的装饰性花卉，能周年繁殖上市，可以广泛用于花坛布置、花槽配置、景点摆设、窗台点缀、家庭装饰。目前，矮牵牛在国际上已成为主要的盆花和装饰植物。矮牵牛销售量大，种植面广，有着很大的发展空间。但矮牵牛特别容易受虫害影响，其中蚜虫尤为严重。蚜虫危害不仅大大降低了矮牵牛的观赏性与装饰性，而且还给工业化生产带来了很大的影响，是一个急待解决的问题。本实验采用根癌农杆菌介导途径。将尾穗苋凝集素基因(AcA)和雪花莲凝集素基因(GNA)的质粒pCAMBIA2300-AG转化进大肠杆菌DH5a感受

2、态细胞进行扩增，继而提取质粒并转化根癌农杆菌LBA4404，通过农杆菌介导途径，用叶盘转化法将质粒转化到矮牵牛中，并最终获得了转基因矮牵牛苗。该研究为矮牵牛抗蚜工作和进一步向矮牵牛导入其他工程基因的研究积累了经验。主要结果如下：1．建立了一套完整的矮牵牛组织培养植株再生系统。本实验借鉴了前人对矮牵牛组织培养的研究成果，采用了BA(苄氨基嘌呤)和NAA(萘乙酸)两种植物生长调节荆进行配比实验。通过不同激素浓度的Ms培养基对矮牵牛叶片进行培养，结果表明增殖培养基MS+6一BA(1．Omg／L)+N从(0．Img／L)对矮牵牛芽的增殖率最高，达到479．

3、2％。2．对质粒转化大肠杆菌和根癌农杆菌的条件进行了优化。摇床的转速达到400rpm时，4-5个小时细菌生长就会进入稳定期，然后迅速过度到衰亡期，出现凝集、沉淀：如果摇床的转速仅为80rpm，细菌生长速度缓慢，24小时后也仅能看到微弱的混浊；摇床转速在180rpm时，细菌生长速度适中，16小时左右0D值可达到O．5左右。在实验中我们发现大肠杆菌DH5a在27℃下振荡培养16h，OD值才达到0．03；温度升高到37℃，4h后oD就已达到0．1。综合以上原因，在培养大肠杆菌时，摇床转速以180rpm为宜，温度37℃为佳，培养时间在16h左右，OD值达到

4、O．5左右，转化效率最高。对比实验表明，质粒提取质量好的，转化效率比质量差的转化效率高。将大肠杆菌和根癌农杆放在低温的CaCl：溶液(4"C)中清洗数次是提高转化率所必需的。液氮在根癌农杆菌转化过程中起着非常重要的作用，在没有液氮的情况下进行转化，转化率几乎为零。3．对根癌农杆菌转化矮牵牛的条件进行了优化。通过对比实验，浸染7～8min为宜。另外，预培养是必需的。未进行预培养的对照出苗率很低仅为1．12％，污染较高i进行预培养2d的出苗率也较低仅为2．53％；进行预培养4d的出苗率最高为5．91％；进行预培养6d的出苗率也较低仅为2．91％。从实验

5、的结果来看，矮牵牛叶片在侵染前预培养4d最佳。共培养天数为0，即侵染后直接进行筛选培养，转化率为O；随着共培养天数的增加，转化率也增加；在共培养天数为4天时，转化率达到峰值，达到5．38％；丽后转化率有所下降。所以，就矮牵牛而言，共培养时间以4d最佳。为了增加筛选的准确性，我们选择卡那浓度为lOOmg／L作为转基因矮牵牛的筛选浓度。在含有500mg／LCef+lOOma／LKan的选择培养基上，愈伤组织的生长明显受到抑制，表现为愈伤组织形成延迟，大约15天才见有少量愈伤形成，一个月后才有大量愈伤组织产生；只有一部分叶片组织脱分化形成愈伤组织。未转化

6、组织在相同选择培养基上不能形成愈伤组织。4．对转基因再生植株进行了卡那霉素抗性分析、PCR、PCR-酶切和虫试检测。通过农杆菌介导法，获得了一些转基因矮牵牛植株。当幼苗长至3—5片真时时，将其转至降低琼脂含量的胚诱导培养基中，进行生根。将根系发育良好的植株经炼苗2周后，移栽至土中。用浓度为1000mg／L卡那霉紊点滴于转化再生苗生长点，其中42棵导入pC&MBIA2300-AG的矮牵牛再生苗中有36棵幼苗没有发生任何变化。而对照幼苗和6棵转基因矮牵牛新生真叶上则出现了黄色斑块。重复2次，观察结果一致。挑选20棵转基因植株以特异引物对GNA基因和AC

7、A基因进行PCR检测。PCR检测结果表明pCAMBIA2300-AG转化再生矮牵牛植株全部为GNA基因阳性。但其中有4株GNA检测为阳性的植株，在检测ACA时却表现为阴性。为了进一步验证GNA和ACA基因的PCR结果是真阳性还是假阳性，我们利用PCR-酶切方法进行了进一步检测。结果表明从转基因植株基因组中扩增出的GNA基因和ACA基因均是真阳性。虫试结果表明pCAMBIA2300一AG的转化再生矮牵牛中不抗、中低抗以及高抗植株所占比例分别为20％，30％和50％。pCAMBIA2300-AG的转基因植株对蚜虫具有明显的抑制作用，蚜口密度抑制率为63

8、．15％，表现出GNA和ACA对蚜虫生长和繁殖的抑制。关键词：矮牵牛，组织培养，农杆菌介导转化，抗性检测UAbstract