GDNF截短异构体胞内运输及分泌的机制研究

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1、山东大学硕士学位论文GDNF截短异构体胞内运输及分泌的机制研究专业：病原生物学硕士生：耿昭指导教师：贾继辉、陈哲宇中文摘要目的：胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是一类调节神经元存活和分化的蛋白质，研究表明GDNF对多巴胺能神经元有保护作用，因而引起了人们对其治疗帕金森病的极大兴趣。GDNF能促进多巴胺能神经元形态分化，使神经元胞体增大、轴突延长。GDNF还对损伤后的中脑多巴胺能神经元有明显作用。GDNF在大鼠脑中的表达主要见于中脑黑质神经元的靶细胞，如纹状体、伏核、丘脑核、嗅结节、海马、小脑、扣带回和嗅球的内颗粒细胞，具有靶源性神经营养因

2、子的作用。GDNF通过与其特异的受体结合，将其生物信号传导至细胞内而发挥相应的生物学效应：细胞膜外蛋白GFRs(GFRal．GFRa4)与特异的GDNF家族成员结合后，才能激活作为公用受体的酪氨酸受体激酶Ret，从而发挥信号转导的作用。即GDNF作用于多巴胺能神经元上的受体GFRal或GFRa2，通过一系列信号转导机制，刺激早期基因编码产生有生物活性的因子，起到稳定细胞内Ca2十等其他离子的作用，从而阻止6．羟多巴胺引起的多巴胺能神经元的损伤。因此，GDNF家族神经营养因子在体内能预防多巴胺能神经元的退行性病变，这一点对于治疗多巴胺代谢紊乱性

3、疾病如帕金森氏病等方面，具有重要的临床意义。GDNF是一个含有二硫键的同源二聚体分泌性蛋白质，其前蛋白含有18个氨基酸残基的信号序列肽，首先合成的是含有211个氨基酸的前体蛋白称为proGDNF，蛋白加工后的成熟蛋白含有134个成熟残基，含有两个糖基化位点，蛋白质水解的同源性序列定位于exonII。最近文献报道GDNF前体在细胞内转运和分泌过程中起到了重要的作用。在特定的某些人群种及啮齿类动物中GDNF山东大学硕士学位论文前体eDNA序列与文献报道的633bp的序列相比缺失了78个碱基(GDNFA78)，这78个碱基的缺失并不产生框移突变，目

4、前我们对GDNFA78知之甚少，因此78个碱基的缺失是否影响人GDNF蛋白的分泌及其活性是本项研究的主要目的。不同的生长因子，如神经营养素家族(NTs)、胰岛素样生长因子(IGF．1)、胶质源性神经生长因子(GDNF)等在神经细胞中通过结构性分泌参与神经元的存活、生长、分化、神经再生、突触形成。GDNFA78对GDNF的加工、运输和分泌是否有影响并未明确，我们通过免疫荧光和Westernblot的方法研究GDNFA78在神经细胞中的定位及其分泌机制。方法：1．在PCI2细胞中检测GDNFA78和GDNFFL对分泌的影响：将GDNFA78和GD

5、NFFL转染PCI2细胞，利用Westernblot的方法检测他们在细胞中的表达，并且建立检测细胞的组成型及调节型分泌(高K+)的方法，研究二者在不同分泌途径中的差异，采用ELISA进一步证实Westernblot的结果，检测GDNFA78和GDNFFL在组成性分泌和调节性分泌中的不同。2．GDNFA78和GDNFFL在神经元中的运输：利用C．末端标记HA标签的质粒转染神经元细胞，用HA和神经元树突标志物MAP2双染观察免疫荧光，判断分泌情况。3．确定GDNFA78异常的运输途径：利用TGN38抗体共定位的方法，确定GDNFA78在高尔基体和

6、内质网中分泌和转运情况。结果：1．Westernblot显示GDNFA78和GDNFFL表达量相同而且均含有前体蛋白和成熟结构。GDNFELISA结果证实了GDNFA78在结构性分泌和调节性分泌中与GDNFFL相比均有较明显的降低。2．免疫荧光显示GDNFA78在PCI2细胞和神经元细胞中聚集在胞体部位的量高于GDNFFL。3．免疫共定位显示GDNFA78与GDNFFL相比在PCI2细胞和神经元细胞中分泌途径主要阻断在高尔基体中。讨论：通过实验证实了GDNF亚型(GDNF△78)在细胞内运输和分泌的不同，强调了GDNF前体蛋白在生物学功能上的

7、重要性。因此，GDNF不同的前体蛋2山东大学硕士学位论文白形式在治疗老年退行性疾病方面有重要价值。对进一步研究GDNFA78在体内运输及生物学功能有着重要的指导意义。关键词：胶质源性神经生长因子；亚型；神经元；细胞内运输；分泌3山东大学硕士学位论文ThestudyofGDNFisoformaffectsinteracelluartraffickingandsecretionofGDNFincellsAbstractPurpose：。Glialcellline-derivedneurotrophicfactor(ODNF)istheprotot

8、ypicmemberofasmallfamilyofneurotrophicfactorsthatpromotethesurvival，neuriteoutgrow