mir-193a影响bvdv在牛胞内复制的分子机制研究

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1、分类号：密级：学号：2012103042单位代码：10759石河子大学硕士学位论文miR-193a影响BVDV在牛胞内复制的分子机制研究学位申请人史梦婷指导教师陈创夫教授申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称生物化学与分子生物学研究方向功能基因与分子免疫所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2015年6月StudyonthethemolecularmechanismsofthecopyofBVDVintracellularaffectedbymiR-193aincowADissertationSubmittedtoShihez

2、iUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofNatureScienceByShiMengting(BiochemistryandMolecularBiology)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuJune,2015石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不

3、包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。课题来源国家自然科学基金新疆联合基金重点支持项目牛病毒性腹泻病毒持续性感染的分子机制研究项目编号：U130328

4、3中文摘要关于BVDV引起的持续性感染发生的分子机制尚未研究清楚，最关键的是BVDV与宿主细胞之间相互作用关系尚未系统性阐述。大量研究表明，当病毒入侵机体细胞，机体细胞会主动诱发凋亡，或凋亡被诱导，进而导致被感染细胞的死亡以及病毒的清除。本实验室前期的实验中使用solexa高通量测序检测了BVDV感染靶细胞MDBK后的差异表达谱显示：miR-193a的表达量显著性升高，且通过生物信息学软件分析miR-193a靶向凋亡通路中的相关基因Bax。所以本研究以miR-193a为研究对象，探究miR-193a作用于靶蛋白，影响凋亡和BV

5、DV复制的分子机制，进而为阐述BVDV的持续性感染和BVDV防控新方法奠定理论基础。[目的]探究miR-193a靶向凋亡通路靶蛋白，进而影响凋亡和BVDV复制的分子机制。[方法]（1）依据本实验室前期高通量测序结果，选择了显著性上调表达的miR-193a进行后续实验；（2）扩增miR-193a前体及其抑制剂pre-miR-193a-IN，并克隆至慢病毒pll3.7载体中；包装慢病毒，感染MDBK细胞；利用qRT-PCR检测过表达和抑制miR-193a的作用效果；(3)转染miR-193a的模拟物和抑制剂进入MDBK细胞，qRT

6、-PCR检测BVDV的复制水平；（4）使用生物信息软件预测miR-193a的靶基因，构建pmirGLO-Bax3’UTR重组荧光载体，与pll3.7-miR-193载体共转染至MDBK细胞，使用荧光分光光度计验证miR-193a直接靶向靶基因；(5)过表达和抑制miR-193a后qRT-PCR检测Bax的转录水平，Westernblot检测Bax蛋白表达量并使用流式细胞仪检测凋亡率；(6)利用Methprimer软件于pre-miR-193a上游设计启动子引物，扩增并克隆至荧光素酶载体pGL3-Basic中，使用荧光分光光度计

7、检测可能的启动子；(7)根据可能的启动子区域设计甲基化检测引物，使用亚硫酸盐修饰处理的BVDV感染和未感染的MDBK细胞全基因组DNA为模板扩增并克隆至T载体中，甲基化测序后分析结果；（8）设计干扰甲基化位点的shRNA，构建shRNA-慢病毒重组载体，包装慢病毒并侵染MDBK后提取全基因组，经亚硫酸盐处理后为模板扩增并克隆至T载体，甲基化测序后分析甲基化程度；（9）检测不同的shRNA-慢病毒处理后，miR-193a的表达水平。[结果](1)过表达pre-miR-193a慢病毒处理后能显著性上调miR-193a的表达；相反，

8、过表达pre-miR-193a-IN慢病毒处理后能显著性下调miR-193a的表达；(2)qRT-PCR检测转染miR-193a模拟物后的BVDV复制水平显著性降低，即过表达miR-193a能抑制BVDV的复制；（3）双荧光素酶报告系统验证miR-193a能直接靶向于Bax蛋