bvdv诊断方法的研究及其在奶牛场净化pi牛中的应用

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1、万方数据StudyofBVDVdiagnosismethodsandtheeliminationofPICattleindairyf．armThe!"submittedtoeslsSUtteQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyLiuHaisheng(CollegeofAnimalScienceandTechnology)Supervisor：ShanHuWuYangongQingdao．ChinaJu

2、ne，2013万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生虢甜寿笙咖：劭侈年知器曰关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手

3、。段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：导师签名：、，到均殳时间：伽13年苫月垢时间：加7弓年名月∥钿万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要BVDV诊断方法的研究及其在奶牛场净化PI牛中的应用摘要牛病毒性腹泻／粘膜病是牛病毒性腹泻病毒引起的以牛发热、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少症、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病。牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavires，BVDV)属于黄病毒科，瘟

4、病毒属。粘膜病的存在会给牧场造成极大的经济损失。因此，掌握我国主要地区牛场的BVDV流行情况，建立准确的分子诊断方法和完善牛场中持续性感染牛(persistentinfection，PI牛)的净化方案，对粘膜病的防治和提高牛场的经济收入具有重要的意义。为了解我国北京、天津、河北、河南、山西、山东、陕西、新疆等我国主要奶牛养殖地区的规模化奶牛场中牛病毒性腹泻的流行情况，本试验采用BVDV抗体检测试剂盒对上述8个地区部分规模化奶牛场的2056份样品进行了检测，其中BVDV抗体阳性牛1590头，平均阳性率为78．1％。天津和北京某奶牛场的阳性率

5、较低，阳性率最高的为河南濮阳某奶牛场，达到94．5％。其余奶牛场阳性率在57．8％到91．7％之间。建立了BVDVt型和2型焦磷酸测序检测方法，用于BVDV的确诊和分型。根据GenBank中发表的BVDV5'-UTR序列，设计通用扩增引物和分别针对BVDV1型和2型的两条测序引物。以BVDVl型BA株和BVDV2型分离株为模板，用通用引物进行RT．PCR扩增，用测序引物对扩增产物进行焦磷酸测序，建立BVDVl型和BVDV2型焦磷酸测序检测方法。结果：焦磷酸测序技术检测的序列为30个碱基以上，可用于BVDV的快速鉴定和分型。用该方法对奶牛场

6、86份抗凝血样品进行检测。共检测出2份BVDV1型，没有检测出BVDV2型。将检测为阳性的RT．PCR产物，送交公司测序，测序结果与焦磷酸测序结果一致，符合率为100％。结论：本研究建立的BVDVl型和2型焦磷酸测序检测方法，可用于BVDV的检测和分型，能一次性对待检样品进行确诊，是一种简便、快速的BVDV分型检测方法，对于BVDV的快速确诊具有重要意义。为了建立一种快速准确的牛病毒性腹泻(BVDV)分型的方法。本研究根据GenBank中公布的BVDVUTR基因序列，设计引物、1型和2型MGB探针。以体外转录的BVDVI型和2型RNA标准

7、品作为模板，优化反应条件，建立标准曲线，并进行特异性、敏感性、重复性试验，最后应用于临床检测。结果以体外转录的BVDVRNA为模板进行试验，该方法检测l型的灵敏度可以达到1．6x102个拷贝／皿，2型的灵敏度可以达到2．1×102个拷贝／IxL检测范围达到7个数量级为102108，建立的方法对猪瘟病毒(CSFV)、牛万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要支气管炎病毒(IBRV)、牛口蹄疫病毒(FMDV)无非特异性扩增。重复性试验的批内BVDV．1型的变异系数CV在1．04％到1．33％之间，BVDV．2型的变异系数CV在O．834％到1．4

8、8％之间。应用所建立的方法对临床样品进行检测，其结果与普通RT一‘PCR结●果的符合率为88．9％。结论该研究建立的一步法双重TaqManMGBreal．timeRT．PCR是一种快速、灵敏性