反雄激素受体基因TFO体外抗前列腺癌细胞增殖作用研究

《反雄激素受体基因TFO体外抗前列腺癌细胞增殖作用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、反雄激素受体基冈TFO体外抗前列腺癌细胞增殖作用研究rn文摘要反雄激素受体基因TFO体外抗前列腺癌细胞增殖作用研究专业：人体解剖与组织胚胎学博士生：张勇指导教师：姚志彬教授摘要研究背景和目的在全球范围内，前列腺癌的发病率在不断增高。临床上约有40％的前列腺癌在确诊时己进入晚期，失去了根治机会，主要依靠激素治疗来延缓肿瘤生长。虽然80％左右的前列腺癌在开始治疗时对激素治疗表现出敏感性，并可获得数月或数年的缓解期，但肿瘤最终会进展到激素治疗抵抗状态而复发。目前对抗拒激素治疗的前列腺癌(HRPC)一般采用化学治疗和二

2、线激素治疗，但作用均非常有限，患者的平均生存期只有4—15个月。近年来的研究表明，雄激素受体(AR)在ItRPC的发生发展中发挥了重要作用。AR可能通过以下几个机制参与HRPC的形成：(1)去势治疗后，虽然血清睾酮水平可减少95“,6以上，但肾上腺来源的雄激素可转变为双氢睾酮激活AR来维持癌细胞的生长；(2)AR基因突变降低了AR与配体结合的特异性，雌激素、孕激素、肾上腺激素甚至雄激素拮抗剂均能与发生突变的AR结合并激活转录，使前列腺癌细胞在缺乏雄激素时，仍可依赖其他类固醇激素获得非雄激素依赖性生长；(3)基因

3、扩增使AR表达增加，提高AR对低浓度雄激素的敏感性，使前列腺癌细胞可以充分利用治疗后残存的激素维持生长：“)在缺少雄激素的环境中，一些生长因反雄激素受体基因TFO体外抗前列腺癌细胞增殖作用研究中文摘要子和蛋自激酶可通过非配体依赖方式激活AR以维持前列腺癌细胞生长。已有研究显示，利用反义技术抑制AR表达可抑制前列腺癌细胞增殖，因此AR基因有望成为治疗前列腺癌的新靶点。本研究采用反基因技术抑制AR表达，探讨反基因治疗前列腺癌的潜在价值，为晚期前列腺癌的治疗提供新的手段。材料和方法1、细胞培养采用含lO％胎牛血清的R

4、PMI1640培养基，在37"(2、5％C0。孵箱内培养LNCaP细胞。2、寡核苷酸三螺旋形成寡核苷酸(TFO)针对AR基因第4外显子编码区内一段同聚嘌呤·同聚嘧啶靶序列设计，序列为5’-GGAGAGGAAGGAGGA一3’；反义寡脱氧瞄漕馥(AsO刚)和序列对照寡脱氧核苷酸(SCOON)的序列均参考相关文献，分别为5’-CTGCTGCTGCTGCTG-3’和5’-ATcGTGGTGTTGATc一3’。为抵抗核酸酶降解，在合成时均作了全硫代磷酸修饰。3、寡核苷酸的转染采用两种方式：(1)直接转染：转染前先将细胞

5、用含2．5％胎牛血清的培养液饥饿培养16h，然后直接加入各种ODNs培养8h，再恢复10％血清常规培养；(2)脂质体转染：参照说明书进行。4、细胞增殖活性检测(1)MTT法：以每孔5×103个细胞种于96孔培养板上，每孔体积90N，培养48h待贴壁后，分别采用裸ODNs直接转染法和脂质体介导法转染细胞，设3个平行孔。①探讨量效关系：采用直接转染法，实验组分别加lOgl各种ODNs，使终浓度均分别为2．5、5、10、15、20Pnol／L，空白对照组不加处理因素，转染后继续培养24h；②探讨时效关系：采用裸ODN

6、s直接转染时，ODNs的终浓度均Ⅱ反罐激索受体鏊楚TFO搏终藏薅列躲癌缨照耀壤佟臻秘究中史摘要取lOP。m01／L，采用脂膝体转染时，ODNs的终浓度均取0．2№ol／I。转染后继绥培养24、48、72h。孵肖结束后各孑LJJHlO州"F，继续培养4h后暖去上层培液，每巍掬入D潲OlOOgl，稍振荡持蓝德溶解后在全离动酶标仪卜测每孔ODa”德。(2)3H—TdR掺入试验：以每孔5x104个细胞种于24孔培养板上，每孔体积0．5ml，螓葵48h待贴爨后，将ODNs转染细胞，壤养24h后起鑫孑L热50越(1驻Ci)

7、。H-TdR，继续培养过夜后终止培养，PBS漂流2次，加10％三氯醋酸洗涤，收集沉淀，嚣液闪测量。5、RT-PCR方法检测AR基因mRNA表这细胞接种于24孔培养板，转染ODNs后，用Trfzol试剂提取总RN&，全最用于逆转录反应以念eDNA。PCR扩增矗R基因片段雳惩簪l甥上游序戮瓷5’-ATGGTGAGCAGAGTGCCCTA-3’，-F游序列为5’-GCC?fGGCAGTCTCCAAACG～3’{扩增内标准p。m基因所用引物上游序列为5’一ATGCCTGCCGTGTGAACCATGT一3’．下游序歹Ⅱ为

8、5’一AGAGCTACCTGTGGAGCAACCT-3’。循强参数为93。C预变经3分镑，93。C变性30秒，58"(2懑火30移，72。C延伸30秒，35个循环稀，72。C延{串7分钟。6、AR蛋自表达检测(1)受体的放射配基结合分析(RBA)：选用3H-R1881为标记配基，浓度取3nmol／L，疑蠲零点法溅定LNCaP细臆中AR蛋白鲍含量。(2)免疫组化研究：参照试裁盒说明书进行