无机砷甲基化及人砷甲基化酶催化机制

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1、南京大学博士学位论文无机砷甲基化及人砷甲基化酶催化机制Methylationofinorganicarsenicandmechanismofthehumanarsenic(+3oxidatilstate)teUanarsenlcOxldationstateI十jmethyltransferase作者：宋晓丽导师：王志林教授2010年6月南京独创性声明作者声明：所呈交的学位论文，是苓人在导师的指导下独立进行的研究工作及所取得的研究成果。尽我所知，除文中特别加以标注和引用的内容外，本论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南京大学或其它教育机构的

2、学位或证书所使用的材料。对本文的研究工作做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中明确说明并表示诚挚的感谢。签名：日期：2010年6月毕业论文题目：垂垫壁里：叁垡盈△壁里叁垡垩咝垡垫剑2007指导教师(姓名、职称)：至：量盐熬撞摘要无机砷(iAs)甲基化是砷在动物体内的主要代谢途径，被公认为砷元素的解毒过程。砷甲基化酶(AS3MT)被确认为iAsul甲基化过程中的生物酶。本文以重组人砷甲基化酶(hAS3MT)及其催化的iAsn‘甲基化为研究对象进行实验。运用酶动力学、正交初速度实验、光谱学、HPLC．ICP．MS等系统研究了hAS3MT中半光氨酸(Cys)残基的作用；探讨了

3、hAS3MT的催化机制；进一步系统研究了硒及过渡金属离子对hAS3MT催化的iAsⅡ1甲基化的影响，初步推测了硒及过渡金属离子的抑制机制。主要工作如下：(1)采用改进的重叠PCR及大引物PCR定点诱变方法以pET-32a-hAS3MT质粒中hAS3MTcDNA编码区为模板设计突变体引物。通过PCR技术以pET-32a．hAS3MT为模板将Cys72、Cys271、Cys334、Cys360及Cys375分别突变成丝氨酸。采用双脱氧法测序检验各突变体DNA序列的正确性。以EcoliBL21(DE3)pLysS为宿主菌，IPTG低温诱导进行突变体蛋白的表达，经Ni-NTAH

4、is．bindresin亲和柱纯化，获得了hAS3MT的五个突变体酶。系统研究了突变体酶的催化活性、动力学、热稳定性、二级结构、并研究了硒对其活性的影响。研究结果表明突变体C72S完全失去了催化iAsul甲基化的活性，其二级结构也有较大的变化，结合以前的研究结果推测Cys72可能与Cys250之间形成T-硫键。Cys271、Cys375不影响hAS3MT的活性和结构。然而，Cys334和Cys360的突变降低了酶的转化率，也在一定程度上改变了hAS3MT的构像。动力学数据表明Cys271、Cys334、Cys360以及Cys375不结合甲基供体(SAM)，但可以结合底物

5、砷(iAslu)以及抑制剂硒(SeⅣ)。另外除了Cys375，其它的Cys残基都能够在一定程度上影响hAS3MT的热稳定性。(2)采用IPTG低温诱导进行蛋白表达，经Ni-NTAHis·bindresin亲和柱纯化匮薯————————————壹蛊盘茔谴±茔逝一．主塞擅差桫获得了重组hAS3MT。通过动力学、初速度、光谱学等研究了hAS3MT的催化机制。结果表明hAS3MT催化的iAsul甲基化是一个多步、按次序进行的反应。甲基化砷(一甲基化砷(MMA)、二甲基化砷(DMA))的含量及形态分布随着酶含量、底物iAsul浓度、SAM浓度、硫醇浓度、pH及孵育时间的变化而改变

6、。这说明iAsul的甲基化及MMA¨1的甲基化之间存在竞争性。在GSH作为还原剂的条件下，hAS3MT的活性在pH8．5时达到最高。hAS3MT的活性中心为含有巯基的Cysl56和Cys206。一般认为Cys残基中巯基的pKa约为8．3。pH8．5的弱碱性环境有利于巯基去质子化及质子化之间的循环平衡从而促进反应的进行，使hAS3MT的反应活性达到最高。通过固定一种反应物的不同浓度改变另一种反应物的浓度，而其它反应物浓度不变的条件下进行iAsⅡ1甲基化反应初速度的研究。根据酶学研究，结果表明SAM、iAsul和hAS3MT的结合是按先后次序进行的；而GSH或作为反应流程中

7、的第一个反应物，或者在一个或多个产物从酶上释放下来之后再与hAS3MT结合。通过紫外光谱、圆二色光谱我们第一次研究了底物iAslll及辅因子与hAS3MT之间的相互作用。结果表明iAsⅡ1和SAM在反应开始之前与hAS3MT结合；而GSH在反应开始前不与hAS3MT结合。综合动力学、初速度和光谱学的研究结果，我们推测iAsul、SAM与hAS3MT的结合是有序的机制且SAM先于iAsHl，iAsⅡ1的甲基化过程是连续甲基化机制而不是氧化甲基化机制，这与Hayawaba课题组所提出的机制在本质上是一致的。然而在我们的机制中，iAsnl不需要