含外源Th细胞表位的HBV+S基因重组载体在酵母中的表达研究

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1、中山大学硕士学位论文中文摘要含外源Th细胞表位的HBVS基因重组载体在酵母中的表达研究专业：内科学(传染病学)硕士生：胡辉指导老师：彭晓谋副研究员摘要乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是最常见的感染性疾病之一。乙肝疫苗作为一种免疫预防的手段，已经取得重大的成就。将乙肝疫苗纳入新生儿计划免疫后，我国儿童的hIBsAg携带率从原来的1096下降到l％左右。但是按推荐方案接种后的无应答率和低应答为5～15％左右，母婴阻断失败率约为lO～39．2％。乙肝疫苗接种失败的原因很多，其中HLAII类抗原的多态性如DRBI*3、D

2、RBI*7、DQBI*0202、DPBI*l101、DRBI*4等和HBVS基因变异逃避是引起疫苗接种失败的主要原因。因此这类人群需要新型高效疫苗。针对慢性乙型肝炎(chronichepatitisB，CHB)的治疗目前主要依靠抗病毒药物如干扰素、拉米夫定等，其近期和远期效果均不理想。HBV是胞内寄生物，它的清除与保护性抗体应答(抗一HBs)、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)和辅助性T淋巴细胞(helperTlymphocyte，Th)l型分泌的多种因子等有关。CHB与自限性乙型肝炎相比较表明，CHB

3、患者不能出现保护性抗体，其特异性的CTL反应、Thl细胞反应和Thl细胞因子(如IFN—Y)也明显低下。因而，有效激活患者自身的免疫功能可能是今后提高CttB治疗效果的重要途径之一。通过对抗原的改造和／或抗原递呈途径的改变是消除机体免疫耐受的有效途径。从分子免疫角度看，HBsAg实际上是由3种表位组成，即Th表位、CTL表位和B细胞表位组成。HBsAg刺激机体产生免疫的过程中，Th细胞通过HLAII类抗原识别相应的Th表位是产生细胞和体液兔疫的关键。HLAII类抗原表现出明显的多态性，接种乙肝疫苗无应答和CHB的发生主要见于HLAII类抗

4、原的某些类型，这些个体的Th细胞不能有效识别HBsAg中Th表位。加入外源Th表位可提高其免疫原性，使先天不应答的动物发生免疫应答。本课题组前期研究中，采I中山大学硕士学位论文中立摘要用了多种外源Th表位，表位分别来自人工表位PADRE、破伤风类毒素的aa830—843、结核杆菌热休克蛋白65的aal-20、风疹蛋白E2—4的aa54—65和沙眼衣原体热休克蛋白60的aa35-48。以不同的组合形式将表位插入ItBVS基因的适当位置并以DNA免疫的研究显示：PADRE单用的体液免疫促进作用最好；MTE5也有较好的促进作用。加上MTE5具有

5、克服HLAII类抗原多态性引起免疫接种失败的潜在能力，因此外源Th表位在改进乙肝疫苗应答效果方面具有重要意义。抗原的表位尚有显性和亚显性之分。显性表位在体内刺激机体产生抗体和CTL反应，但易发生变异逃避：亚显性表位在体内刺激机体产生抗体和CTL反应明显减弱，但不存在变异问题。在免疫耐受机体内，亚显性表位不发生耐受。其不出现免疫应答的原因是不能与HLAII类抗原有效结合。HBVS蛋白的a决定簇第二环(aal39—147)是显性表位，而在其它部位尚有多个亚显性表位。为此，课题组前期研究中采用基因拼接技术，将flBsAgⅡ决定簇第二环的aal3

6、9—145缺失，采用外源Th表位加强与HLAII类抗原的结合能力，构建了亚显性ttBVS基因载体和MTE5辅助的相应重组载体。DNA免疫后有低水平的抗体反应，尽管较完整HBVs基因低，但提示利用亚显性表位免疫来对抗免疫逃避和治疗CHB是可能的。然而，DNA免疫不能确定外源Th表位的免疫促进作用是其直接作用，还是促进重组蛋白的表达来实现的：亚显性表位免疫应答较差也需要排除其在蛋白表达水平相对较低的可能性；PADRE在辅助完整HBVS基因有较好的效果，其辅助亚显性HBVS基因的效果也值得探讨；此外该项目需向应用和开发研究延伸等因素。有必要对重

7、组HBgS基因载体进行蛋白质表达研究。为此，本研究在前期实验基础上，补充构建PADRE辅助的亚显性重组载体，选用毕赤酵母表达系统，进行蛋白质表达研究。一、材料与方法1．五个重组酵母载体的构建使用PCR方法分别从真核表达质粒pltB—SD、pnB、pHB—PADRE、pHB-MTE5一SD和pHB-MTE5上获取目的基因。PCR产物双酶切纯化后，连接于经同样酶切的酵母表达载体pPIC9。连接产物转化JMl09感受态细胞。提取重组质粒，使用限制II中山大学硕士学位论文中文摘要性酶切片断长度多态性分析(restrictionfragmentle

8、ngthpolymorphismanalysis，RFLP)进行初步鉴定，最后经DNA序列测定，确认出重组质粒pHB-SDY、pHBY、pHB—PADREY、pHB—MTE5一SDY、pHl3